[發明專利]一種利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201811608045.1
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109762781A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 劉召青;年泗利;張亮亮;齊念民
• 申請（專利權）人: 上海坤愛生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 周君;胡晶

1.一種利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、選取胎盤，并對胎盤進行檢測，確保病毒檢測結果全陰性；剪取胎盤上新鮮的絨毛膜樣品組織；

步驟二、將剪取獲得的樣品組織置于磷酸緩沖鹽溶液中進行清洗；

步驟三、挑取顏色鮮艷的清洗好的樣品組織，去除可見大血管、殘余胎盤隔組織，再將樣品組織剪成樣品組織碎片；

步驟四、在樣品組織碎片中加入消化液，并進行搖晃消化；待消化進行到30％-70％時，再通過培養液終止，獲得其中松散的組織塊；

步驟五、將松散的組織塊平鋪接種于培養容器中，靜置；

步驟六、待培養容器中的組織塊的周圍干燥后，加入培養液，以使得組織塊與培養液充分接觸，再將其放入到培養箱中進行培養；

步驟七、待組織塊周圍細胞形成密集集落時，進行傳代培養；

步驟八、傳代培養完成后，采用磷酸緩沖鹽溶液進行清洗，再重組消化酶或胰酶消化后，待細胞變圓、脫落，停止消化，終止后收集細胞懸液；將細胞懸液去上清，將細胞沉淀重懸，按每皿不低于2.0×105個細胞接種于平皿中；

步驟九、待細胞長至80-90％密度時，獲得間充質干細胞，進行凍存。

2.根據權利要1所述的利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟一中選取好的胎盤需經過乙肝、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨細胞病毒的檢測，確保全陰性。

3.根據權利要1所述的利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟一中將胎盤上的底蛻膜剪去，并去除羊膜下層的絨毛模板層后，選取胎盤上，胎兒面臍帶下端0.5-2cm新鮮絨毛膜樣品組織。

4.根據權利要1所述的利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟二中的磷酸緩沖鹽溶液含有青霉素鏈霉素。

5.根據權利要1所述的利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟四中的搖晃消化過程具體為：采用恒溫搖床消化，期間每隔10-30min，手動搖晃一次，消化時間為0.5-2h。

6.根據權利要1所述的利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟四中通過過濾或者低速離心機離心的方式，棄上清、取沉淀，從而獲得組織塊。

7.根據權利要1所述的利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟六中培養箱的培養環境為37℃、5％CO₂的含量。

8.根據權利要1所述的利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟六與步驟七之間進一步的包括以下步驟：

S1、2-3天后，觀察組織塊漂浮情況，并補加培養液；

S2、6-8天后，換1次培養液，或每隔4天半量換液一次。

9.根據權利要1所述的利用聯合法從胎盤絨毛膜中提取間充質干細胞的方法，其特征在于，步驟八中，重組消化酶消化8-10min，或者0.25％的胰酶消化1min左右。