[發明專利]一種基于SCoT標記的PCR擴增產物的分離方法

在審

• 申請號: 201811602186.2
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109609494A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 史衛東;羅海玲;康紅衛;熊發前;韋愛培
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 代芳

本發明提供了一種基于SCoT標記的PCR擴增產物的分離方法，涉及基因工程技術領域，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳SCoT標記的PCR擴增產物，實現SCoT標記的PCR擴增產物的分離。根據本發明實施例和對比例可以得出，采用瓊脂糖凝膠電泳對SCoT標記的PCR擴增產物分離，得到的條帶較暗，不清晰，不能夠準確鑒定差異片段；采用本發明提供的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對SCoT標記的PCR擴增產物的分離，得到較亮、清晰的條帶，能夠準確鑒定差異片段。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種基于SCoT標記的PCR擴增產物的分離方法。

背景技術

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此電泳速度不同，根據這個原理可將分子量不同的分子分開。電泳緩沖液的pH值在6～9之間，最適離子強度為0.02～0.05。常用1％的瓊脂糖作為電泳支持物，瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。

目前SCoT標記的PCR擴增產物是通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，存在問題是SCoT標記的數量不多，瓊脂糖凝膠電泳后的很多條帶不清晰，測序結果不準確。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于SCoT標記的PCR擴增產物的分離方法，采用本發明提供的方法能夠將SCoT標記的PCR擴增產物分離，且條帶清晰，測序結果準確。

本發明提供了一種基于SCoT標記的PCR擴增產物的分離方法，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離SCoT標記的PCR擴增產物，實現SCoT標記的PCR擴增產物的分離。

優選的，所述非變性聚丙烯酰胺凝膠的原料為：Acr溶液、Bis溶液、10XTBE和ddH₂O；

所述Acr溶液與Bis溶液、10XTBE、ddH₂O的體積比為24:12.84:12:70.8；

所述Acr溶液的質量濃度為40％；

所述Bis溶液的質量濃度為2％；

所述10XTBE的pH值為8.3。

優選的，所述電泳的條件包括：所述電泳的電壓功率為120w，所述電泳的時間為5h。

本發明還提供了上述技術方案所述的分離方法在獲取感蟲菜心和抗蟲菜心基因間差異片段中的應用。

優選的，所述獲取感蟲菜心和抗蟲菜心基因間差異片段使用的SCoT引物如SEQ IDNo.1～20所示。

優選的，所述獲取感蟲菜心和抗蟲菜心基因間差異片段使用的PCR體系含有氯化鎂、SCoT引物、dNTPs、taq DNA聚合酶和基因組DNA；

所述PCR體系中氯化鎂的濃度為1.5mmol/L；

所述PCR體系中SCoT引物的濃度為0.5μmol/L；

所述PCR體系中dNTPs的濃度為0.5mmol/L；

所述PCR體系中taq DNA聚合酶活性為1.25U/20μL；

所述PCR體系中基因組DNA的含量為50ng/20μL。