[發(fā)明專利]一種不在原核生物中表達的抗生素類轉(zhuǎn)基因植物標記基因的獲得方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811601690.0
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109593770A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭琦;陳松;張維;張潔夫;浦惠明;高建芹;周曉嬰;陳鋒;胡茂龍;付三雄;龍衛(wèi)華;王曉東;孫程明;郭月;熊冬琴;程麗
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/82
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 程斯佳

一種不在原核生物中表達的抗生素類轉(zhuǎn)基因植物標記基因的獲得方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。是在pCAMBIA2300，簡稱B1載體的nptⅡ基因序列中設(shè)計替換為插入內(nèi)含子序列的hpt基因序列。所設(shè)計的內(nèi)含子序列Int來自甘藍型油菜pgip2基因，序列號：EU142024.1，長72bp。具體方法為：抗潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hpt基因特定位點插入內(nèi)含子序列Int后，hpt?Int1、hpt?Int2序列通過重組方式替換掉B1載體T?DNA區(qū)的原有nptⅡ基因序列，新載體分別命名為B1?hpt?Int1和B1?hpt?Int2。所述新載體B1?hpt?Int1或B1?hpt?Int2在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種不在原核生物中表達的抗生素類轉(zhuǎn)基因植物標記基因的獲得方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

二、背景技術(shù)

目前在植物遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應(yīng)用的標記基因主要有2大類，一類是編碼可使抗生素失活的蛋白酶基因，包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt Ⅱ)(Bevan et al.1983)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)(Ortiz et al. 1996)等。另一類是編碼可使除草劑失活的基因，包括膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar,pat)(Thompson et al.1987；Wohlleben et al.1988)和5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因(epsps)(Howe et al.2002)等。這兩類基因均屬于傳統(tǒng)的選擇標記基因，其成熟的技術(shù)體系和廣泛的適用性，使得轉(zhuǎn)化工作能夠更加順利地開展(Ramessar et al.2007)。但一旦轉(zhuǎn)化成功，標記基因便不再有用，甚至對生態(tài)環(huán)境和食品安全存在潛在威脅(馬忠強2009)。

對于抗生素類標記基因安全性，人們的擔憂主要包括環(huán)境和食品安全兩個方面，(1)可能會轉(zhuǎn)移到微生物中，使得病原菌獲得抗生素抗性，從而導(dǎo)致目前臨床使用的抗生素失效；(2)可能對人類與動物健康產(chǎn)生負面影響。從大量的試驗數(shù)據(jù)(Bennett et al.2004；Goldstein et al.2005；Ramessar et al.2007)以及多個權(quán)威機構(gòu)和國際組織(NZ ERMA2000；FAO/WHO 2000；OECD 2000；USA FDA 2001；CAC 2003a；EFSA 2007)發(fā)布的風險評估報告來看抗生素標記基因從轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移至土壤微生物或腸道微生物的風險性非常小，對環(huán)境或人類與動物的健康也并不產(chǎn)生危害，但人們還是希望通過一些新的技術(shù)手段或開發(fā)一些新的安全性標記基因來進一步提高轉(zhuǎn)基因的安全性。

在轉(zhuǎn)基因植物中提高其安全性的有效手段之一就是培育無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中的有效策略是采取一系列措施在轉(zhuǎn)化植株篩選完成后將選擇標記基因去除。目前剔除轉(zhuǎn)基因植物選擇標記基因的方法主要有4種：共轉(zhuǎn)化法(Komari et al.1996；Luet al.2001)、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(Cotsaftis et al.2002)、位點特異性重組酶系統(tǒng)(Woo etal.2009)和染色體內(nèi)重組系統(tǒng)(Zubko et al.2000)。這些方法能完全消除對標記基因的質(zhì)疑，有利于多基因轉(zhuǎn)化。但是，這些方法也存在耗時長、工作量大、轉(zhuǎn)化率低等缺點，而且受到植物繁殖方式的限制，還有待進一步研究探索。

30年前真核細胞含有斷裂基因(split gene)的發(fā)現(xiàn)引起人們的震驚，斷裂基因由表達的外顯子(exon) 和不表達的內(nèi)含子鑲嵌構(gòu)成。這種基因結(jié)構(gòu)大量存在于真核生物，特別是多細胞生物，而在原核生物中，僅在一些古細菌中檢出幾個斷裂基因和疑似的斷裂基因。因此，基因結(jié)構(gòu)的差異造成真核生物基因表達時內(nèi)含子和編碼區(qū)域會一起被轉(zhuǎn)錄到前體RNA中，在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中內(nèi)含子被切除，于是在DNA水平上呈非連續(xù)性的編碼區(qū)域便在RNA水平上變成連續(xù)的了。內(nèi)含子的這種捻接過程需要有剪切體的存在，而且對內(nèi)含子序列的識別具有保守性。目前比較常見的是GT-AG內(nèi)含子，GC-AG內(nèi)含子和AT-AC內(nèi)含子(Thanaraj et al.2001)。