[發明專利]一種不在原核生物中表達的抗生素類轉基因植物標記基因的獲得方法

在審

• 申請號: 201811601690.0
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109593770A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 彭琦;陳松;張維;張潔夫;浦惠明;高建芹;周曉嬰;陳鋒;胡茂龍;付三雄;龍衛華;王曉東;孫程明;郭月;熊冬琴;程麗
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/82
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 程斯佳

1.一種不在原核生物中表達的抗生素類轉基因植物標記基因的獲得方法，其特征在于，是將pCAMBIA2300載體，簡稱B1載體中的的nptⅡ基因替換為插入內含子序列Int的抗潮霉素磷酸轉移酶基因hpt基因序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的內含子序列Int來自甘藍型油菜pgip2基因，序列號：EU142024.1，長72bp,如SEQ.ID.NO.1所示：

5’-GCAAATAAACTCTGTTTTTTACTTTTTTGCCTTTCTTTCTAAATCTGATCAAGAAACTTTTCATGCGAGCAG-3。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，具體方法為：

1)抗潮霉素磷酸轉移酶基因hpt基因插入內含子序列后hpt-Int1序列1098bp如SEQ.ID.NO.2所示：

5’-atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggagtttagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctacaaccggtcgcggaggctatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgagGTAAATAAACTCTGTTTTTTACTTTTTTGCCTTTCTTTCTAAATCTGATCAAGAAACTTTTCATGCGAGCAGgtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccacgactccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaagaaatag-3’

2)hpt基因插入內含子序列后hpt-Int2序列1098bp,如SEQ.ID.NO.3所示：

5’-atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggagtttagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctacaaccggtcgcggagGCAAATAAACTCTGTTTTTTACTTTTTTGCCTTTCTTTCTAAATCTGATCAAGAAACTTTTCATGCGAGCAGgctatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccacgactccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaagaaatag-3’

3)hpt-Int1、hpt-Int2序列合成后通過重組方式替換掉B1載體T-DNA區的原有nptⅡ基因序列，構建完成后的載體經XhoI單酶切驗證，以切出目的條帶為構建成功。如圖1所示，表明hpt-Int1和hpt-Int2序列已經成功替換掉nptⅡ基因，新載體分別命名為B1-hpt-Int1和B1-hpt-Int2。