[發(fā)明專利]一種酶活提高的金屬β-內(nèi)酰胺酶突變體及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811601230.8
• 申請(qǐng)日: 2018-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN109337889B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李潤(rùn)明;羅春;郝宇;丁姝元;邱壯偉;王金剛;陳舒明;粱巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司;上海駿捷生化科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/86
• 分類號(hào): C12N9/86;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;宋靜娜

本發(fā)明涉及一種酶活提高的金屬β?內(nèi)酰胺酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明酶活提高的金屬β?內(nèi)酰胺酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明采用單點(diǎn)突變技術(shù)，基于同源建模方法，通過(guò)選擇特定氨基酸優(yōu)化金屬β?內(nèi)酰胺酶分子結(jié)構(gòu)、提高酶活，對(duì)于滿足金屬β?內(nèi)酰胺酶工業(yè)化成產(chǎn)需求和降低生產(chǎn)成本有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶活提高的金屬β-內(nèi)酰胺酶突變體及其構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

自1929年青霉素發(fā)明以來(lái)，抗生素在防治細(xì)菌性疾病方面，發(fā)揮了巨大的作用。但是，由于抗生素的長(zhǎng)期大量使用，特別是不規(guī)范地濫用抗生素，導(dǎo)致了日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問題。細(xì)菌耐藥最主要的機(jī)制是產(chǎn)生滅活酶，如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶等。β-內(nèi)酰胺酶能夠與β-內(nèi)酰胺的羧基共價(jià)結(jié)合，使其酰胺鍵水解，滅活青霉素和/或頭孢菌素。β-內(nèi)酰胺酶種類較為復(fù)雜，到目前已發(fā)現(xiàn)有三百多種，并且由于超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素的大量使用，出現(xiàn)了耐受超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)。根據(jù)末端氨基酸序列及編碼基因的位點(diǎn)可將β-內(nèi)酰胺酶分成A、B、C和D四類：SHV屬于A類，金屬酶屬于B類，AmpC酶屬于C類，0XA型酶屬于D類。A型和D型酶屬于青霉素酶；C型酶屬于頭孢菌素酶；B型酶依靠金屬離子而保持活性，因此被稱為金屬酶。

B型β-內(nèi)酰胺酶能分解除單環(huán)類抗生素外所有的β-內(nèi)酰胺類藥物，即對(duì)其耐藥。克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等酶抑制劑對(duì)其也不能抑制，細(xì)菌攜帶此酶已成為臨床中的大問題。B型β-內(nèi)酰胺酶，也稱金屬β-內(nèi)酰胺酶(MβPs)，是依靠Zn²⁺或者其他重金屬離子來(lái)發(fā)揮催化活性的水解酶，也是一個(gè)種類繁多的超級(jí)家族。MβPs主要產(chǎn)于一些病原菌，其基因?qū)儆谫|(zhì)粒編碼。

IMP和VIM是兩種典型的MβPs，基因依靠質(zhì)粒編碼，具有很多變異型。目前MβPIMP已由最初的IMP-1演變成有26種變異體的大家族，VIM型由最初的VIM-1發(fā)展成23個(gè)變異體的體系。這兩種酶不僅含有耐藥的基因卡盒，還含有與轉(zhuǎn)座子相關(guān)的整合子(基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng))結(jié)構(gòu)，可以嵌入細(xì)菌的染色體和質(zhì)粒中，整合子結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)整合子在質(zhì)粒間的移動(dòng)，質(zhì)粒可以幫助耐藥基因在不同細(xì)菌間傳遞。

近年發(fā)現(xiàn)的NDM-1，屬于B1MβPs，是一個(gè)雙核Zn結(jié)構(gòu)，能水解所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，便引起了世界衛(wèi)生組織的恐慌。2008年，在一個(gè)由印度返回瑞典的病人身上采集的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌中，首次發(fā)現(xiàn)NDM-1。在印度的腸桿菌科菌株中經(jīng)常可檢測(cè)到NDM-1，科學(xué)家在INCA/C、IncF、IncL/M型染色體中發(fā)現(xiàn)了blaNDM-1基因，這種基因可依靠結(jié)合的方式在革蘭氏陰性菌之間自由地傳遞，但是與IMP-MPL和VIM-MPL不同的是，它沒有整合子結(jié)構(gòu)。到2010年8月，含有NDM-1基因的陽(yáng)性菌在全球廣泛傳播，在南美發(fā)現(xiàn)的病例尤為多，大部分病菌攜帶者與印度等次大陸的傳染病有一定聯(lián)系，小部分來(lái)自于中國(guó)和南亞。目前，臨床上在很多來(lái)自各種疾病(泌尿感染、敗血癥、肺結(jié)核、腹膜炎及軟組織感染等)的腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)NDM-1，而且在醫(yī)院和社區(qū)中都有獲得性細(xì)菌感染的相關(guān)報(bào)道，可看出，攜帶NDM-1的細(xì)菌幾乎是無(wú)孔不入的。

根據(jù)已知序列，金屬β-內(nèi)酰胺酶可分為B1、B2、B3個(gè)亞族。B1亞族是金屬β-內(nèi)酰胺酶最大的分支，其基因?qū)儆谌旧w編碼，在銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性致病菌中可傳播這種耐藥基因。MOLS的底物范圍很廣，幾乎可水解所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素，但是B2亞族金屬β-內(nèi)酰胺酶是一個(gè)例外，它可專一水解碳青霉烯類抗生素，此類MβPs包括lmiS、CphA和Sfh-1。B3亞族金屬β-內(nèi)酰胺酶跟其他兩類相比，只含有9個(gè)保守的殘基，主要包括從臨床致病菌中得到的U、GOB-1和FEZ-1，其中GOB-1酶己經(jīng)有18種變異體，在GOB酶中His16被谷氨酸鹽替代，THIN-B、Mbl和BJP-1是從環(huán)境細(xì)菌中得到的。