[發明專利]一種環孢霉素A免疫原的制備方法、環孢霉素A免疫原和抗環孢霉素A特異性抗體

在審

• 申請號: 201811600848.2
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109627321A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 許秀麗;王艷新;常緣榮;周建平
• 申請（專利權）人: 北京丹大生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/435;C07K14/795;C07K16/44;G01N33/53
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種環孢霉素A免疫原的制備方法，屬于酶聯免疫檢測技術領域，包括以下步驟：將環孢霉素A與草酰氯在氯仿中反應，得到環孢霉素A羧基衍生物；將得到的環孢霉素A羧基衍生物與碳二亞胺、載體蛋白混合、偶聯，得到環孢霉素A免疫原。采用本發明的制備方法得到環孢霉素A免疫原，再將環孢霉素A免疫原制備成抗環孢霉素A特異性抗體，該特異性抗體能夠特異性識別環孢霉素A，與去甲環孢素、羥化環孢素和二羥化環孢素等存在極微弱的交叉反應。

技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術領域，具體涉及一種環孢霉素A免疫原的制備方法、環孢霉素A免疫原和抗環孢霉素A特異性抗體。

背景技術

環孢霉素A是一種高效免疫抑制劑，臨床主要用于肝、腎、胰、心、肺、皮膚、角膜及骨髓移植，以減輕或防止排斥反應，提高患者的生存率和移植物的存活率。但由于其治療窗狹窄，藥動學參數個體差異大，低于有效濃度易引起排斥反應或誘發自身免疫性疾病，高于有效濃度則易引起感染或肝、腎及中樞神經系統損害。而且，CsA血藥濃度水平易受性別、年齡、肥胖、肝功能、胃腸功能、藥物相互作用以及飲食等眾多因素的影響。因此，監測全血中CsA的血藥濃度并調整其濃度在有效范圍已成為臨床合理使用CsA的重要方法。

目前已知的環孢霉素A(cyclosporine A,CsA)在體內的代謝產物有15種之多，主要以去甲環孢素，羥化環孢素及二羥化環孢素三種代謝物為主。因此在環孢霉素A的血藥濃度監測過程中，特異性的測定CsA不受其代謝物的影響，是準確反映CsA藥代動力學過程及安全用藥的重要前提。

目前，體外測定環孢霉素A的方法主要高效液相色譜法，有放射免疫法(RIA)，化學發光免疫法(CLIA)，熒光偏振法(FPIA)，酶聯免疫吸附法(ELISA)，膠乳增強比濁法。其中，高效液相色譜法，能夠識別環孢霉素A及其類似物，但其設備昂貴，操作復雜，需要前處理，通量小，不適合在臨床推廣。而放射免疫法(RIA)，化學發光免疫法(CLIA)，熒光偏振法(FPIA)，酶聯免疫吸附法(ELISA)，膠乳增強比濁法，均是基于抗原抗體的免疫反應原理，因此試劑使用的CsA抗體的特異性就決定了檢測試劑對CsA藥物監測的特異性。然而，目前已知多數商品化CsA測定試劑并不是特異性識別CsA，同CsA的主要代謝物，去甲環孢素、羥化環孢素和二羥化環孢素存在較大的交叉反應。

發明內容

本發明的目的在于提供一種環孢霉素A免疫原的制備方法，采用本發明的制備方法得到環孢霉素A免疫原，再將環孢霉素A免疫原制備成抗環孢霉素A特異性抗體，該特異性抗體能夠特異性識別環孢霉素A，與去甲環孢素、羥化環孢素和二羥化環孢素等存在極微弱的交叉反應。

本發明提供了一種環孢霉素A免疫原的制備方法，包括以下步驟：

1)將環孢霉素A與草酰氯在氯仿中反應，得到環孢霉素A羧基衍生物；

2)將所述步驟1)得到的環孢霉素A羧基衍生物與碳二亞胺、載體蛋白混合、偶聯，得到環孢霉素A免疫原。

優選的，所述步驟1)環孢霉素A與草酰氯的質量比為(8～12):(7～7.5)。

優選的，所述步驟1)環孢霉素A與草酰氯的質量比為10:7.23。

優選的，所述步驟1)環孢霉素A的質量與氯仿的體積比為(8～12)g:(35～45)ml。

優選的，所述步驟1)反應的時間為4.5～5.5h，所述反應在攪拌下進行，所述攪拌的速度為450～550rpm。

優選的，所述步驟2)環孢霉素A羧基衍生物與碳二亞胺、載體蛋白的質量比為(90～110):(45～55):(90～110)。

優選的，所述步驟2)載體蛋白包括牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、雞卵清蛋白或血藍蛋白。

優選的，所述步驟2)偶聯的時間為2.5～3.5h。