[發明專利]用于檢測艱難梭菌基因的引物組合物、試劑盒及試劑盒的應用

在審

• 申請號: 201811600801.6
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109439781A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 蔣健暉;王海波;唐麗娟
• 申請（專利權）人: 湖南融健基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/145
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所(普通合伙) 43008
• 代理人: 陳暉

本發明公開了一種用于檢測艱難梭菌基因的引物組合物、試劑盒及試劑盒的應用，其中引物組合物為用于檢測gluD基因的引物組合物、用于檢測tcdA基因的引物組合物、用于檢測tcdB基因的引物組合物、用于檢測cdtA基因的引物組合物和用于檢測cdtB基因的引物組合物中的一種或多種；試劑盒包括上述的引物組合物、dNTP、聚合酶、反應緩沖液、熒光試劑。本發明的引物組合物根據艱難梭菌幾種保守基因序列所設計，能更準確的判斷是否為艱難梭菌以及確定產毒艱難梭菌的毒素類型，可應用于艱難梭菌的LAMP檢測，具有靈敏性高，特異性強等優勢。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及用于檢測艱難梭菌基因的引物組合物、試劑盒及試劑盒的應用。

背景技術

艱難梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)是一種嚴格厭氧生長的革蘭陽性梭狀芽孢桿菌，為人類腸道中的正常菌群。是一種機會致病菌，生存環境惡劣情況下可以形成次極端芽孢的專性厭氧菌。大量應用廣譜抗生素等原因造成腸道穩態失衡,該菌過度繁殖，引起CDAD(艱難梭菌相關性腹瀉)。艱難梭菌(Clostridium difficile)屬厭氧性細菌，是引起院內腸道感染的主要致病菌之一。臨床上，約15％～25％的抗菌藥物相關性腹瀉，50％～75％的抗菌藥物相關性結腸炎和95％～100％的偽膜性腸炎是由CDI(艱難梭菌感染)引起。CDI主要是由于長期或不規范使用抗菌藥物而導致腸道菌群紊亂而最終產毒艱難梭菌在人類腸道過度繁殖引起。主要臨床癥狀為發熱、腹痛以及水樣便腹瀉。輕者引起腹瀉，嚴重者引起偽膜性腸炎，且常伴有中毒性巨結腸、腸穿孔、感染性休克等并發癥，甚至最終導致死亡。在美國和歐洲，CDI已成為相關性腹瀉的首要病因，總體發病率高于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染，而在中國CDI潛在威脅遠高于國際水平，臨床需求較明確。

艱難梭菌可分為產毒株和不產毒株，不產毒株不引起臨床癥狀。艱難梭菌產毒株的產毒因子主要包括毒素A和毒素B，由tcdA和tcdB編碼，而tcdA和tcdB受負向調節基因tcdC、正向調節基因tcdD以及膜孔蛋白基因tcdE調節，以上基因共同構成了致病決定區。毒素A又稱腸毒素，易導致回腸腸壁中性粒細胞浸潤，釋放淋巴因子，引起液體大量分泌和出血性壞死；毒素B又稱細胞毒素，能使肌動蛋白解聚，損壞細胞骨架，導致細胞固縮壞死，直接損傷腸壁細胞。此外，在北美洲和歐洲引起廣泛暴發流行的027型艱難梭菌可以產生更強的毒素，即二元毒素(binarytoxin，CDT)。CDT由CDT a和CDT b這兩種獨立蛋白鏈組成，由致病性決定區外的2個染色體基因cdt A基因和cdt B基因編碼。cdtA是一種ADP核糖轉移酶，可阻斷肌動蛋白片段的合成而誘導細胞死亡，cdtB是一種運輸蛋白，被絲氨酸蛋白酶激活后，cdtB通過與宿主細胞結合，把cdtA轉移至細胞液中，誘導細胞骨架解聚，生成微管突出物，增強艱難梭菌的定植。

目前對于艱難梭菌的檢測的主要對象是細菌、毒素、毒素基因、乳酸脫氫酶。目前國際公認鑒定艱難梭菌的“金標準”仍然是傳統的糞便標本培養和細胞毒素實驗，但周轉時間長、操作難、設備技術要求高。目前并未常規應用于臨床微生物實驗室；GDH(谷氨酸脫氫酶)是所有艱難梭菌高水平表達的代謝酶(艱難梭菌中GDH抗原由gluD基因編碼)，可用于篩查疑似艱難梭菌患者糞便樣本，能夠通過EIAs(酶聯免疫法)直接檢測糞便中的GDH抗原，操作簡單、快速且敏感度高，但是由于不能區分產毒和非產毒艱難梭菌而只能作為一種高度敏感的初篩手段；EIAs直接檢測糞便中的艱難梭菌毒素，通過單克隆抗體特異性結合艱難梭菌A/B毒素蛋白進行檢測，特異性高，能區分產毒和非產毒艱難梭菌，且檢測周期短，數小時能出結果，操作簡便、應用廣泛，但是敏感性較低(39％～76％)，因此常和GDH檢測或核酸擴增技術聯合應用，用于艱難梭菌感染實驗室兩步法或三步法診斷。PCR法檢測CDI具有快速、準確、可定量等優勢，其中TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、復合探針、染料及分子信標等方法目前已成功應用到病原菌分子診斷領域，但是同時面對的一個問題是價格比較貴，檢測成本比較高，臨床推廣有一定難度。因此，開發一種快速、特異、靈敏且成本相對更低的艱難梭菌毒素基因檢測方法意義重大。