[發明專利]一種L-天冬氨酸-α-脫羧酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201811600551.6
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109735522B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 于欣君;陳虹;汪釗
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種L?天冬氨酸?α?脫羧酶突變體及在轉化L?天冬氨酸生產β?丙氨酸中的應用，所述突變體是將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第98位、305位、451位、111位、139位、403位、469位、372位、325位進行單突變或多突變獲得的。本發明通過比較突變體酶PanD^R98H?K305E、PanD^{R98H?K305E?I451V}和未突變酶在偏中性條件下的催化能力，結果發現在pH7.0條件下，突變體酶PanD^R98H?K305E、PanD^{R98H?K305E?I451V}催化L?天冬氨酸生成β?丙氨酸的轉化率分別為未突變酶的3.33倍、2.76倍。

(一)技術領域

本發明涉及一種機突變獲得的L-天冬氨酸-α-脫羧酶突變體及其應用，屬于基因工程技術領域。

(二)背景技術

β-丙氨酸是自然界中天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，又被稱作為β-氨基丙酸或者3-氨基丙酸。β-氨基酸是一種潛在的功能性氨基酸。在工業上，β-氨基酸作為一種非常重要的前體物質，在醫藥、保健品、化工產品、食品及飼料等方面均有廣泛應用。在醫藥方面，β-丙氨酸廣泛應用于合成泛酸和泛酸鈣，也是合成肌肽的主要前體物質。β-丙氨酸還可用于合成帕米磷酸二鈉，用于緩解腫瘤腫瘤性骨痛和治療高血鈣癥，以及用于合成巴柳氮治療結腸炎和直腸炎。在化工產品方面，在食品和飼料方面，β-丙氨酸可作為調味劑，運動營養補充劑，還能提高動物肉制品質，滿足市場對瘦肉的需求。在化工產品方面，β-丙氨酸可用于合成沉淀劑，制備電鍍緩蝕劑和鉛中毒解毒劑。

目前國內外產β-丙氨酸主要是化學合成法與生物法。

化學合成主要是丙烯腈法、丙烯酸法以及琥珀酰亞胺降解法。化學法雖然反應效率高，生產速率快，但是需要強酸強堿以及高溫高壓的條件，污染環境。且副反應復雜，對后期純化也有一定的影響。

生物法合成β-丙氨酸主要有酶法和代謝法。酶法有有機腈降解酶催化β-氨基丙腈和L-天冬氨酸-α-脫羧酶作用下合成丙氨酸。以L-天冬氨酸為底物，在和L-天冬氨酸-α-脫羧酶作用下，脫去α位羧基生成β-丙氨酸，目前也被廣泛運用與工業合成β-丙氨酸。

目前L-天冬氨酸-α-脫羧酶的研究越來越多，大部分的研究主要集中到Escherichia coli、Corynebacterium glutamicum、Bacillus subtilis、Mycobacteriumtuberculosis等微生物。高麗娟等將大腸桿菌panD基因轉至BL21(DE3)中進行高效表達，研究酶轉化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸的催化能力，每升發酵液酶活達到225U。石增秀等將谷氨酸棒桿菌L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達，重組酶比酶活達到156mmol·g^-1·h^-1。

本發明旨在對Tribolium castaneum來源的L-天冬氨酸α脫羧酶進行隨機突變，提高酶活、產量及催化穩定性，提高其工業應用價值和生產效率。

(三)發明內容

本發明提供了一種L-天冬氨酸-α-脫羧酶突變體，其在偏中性條件下，生物合成β-丙氨酸的酶活有明顯的提高。

本發明采用的技術方案：

本發明提供一種L-天冬氨酸-α-脫羧酶突變體，所述突變體是將SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第98位、305位、451位、111位、139位、403位、469位、372位、325位進行單突變或多突變獲得的。