[發(fā)明專利]一種內皮祖細胞的培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811599511.4
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109456936A
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發(fā)明（設計）人: 陳海佳;葛嘯虎;張夢晨;王小燕;李學家
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/078
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權代理有限公司 11227
• 代理人: 張雪嬌;趙青朵

本發(fā)明提供了一種內皮祖細胞的培養(yǎng)方法，包括：S1)將單個核細胞進行貼壁培養(yǎng)，消化后，得到擴增后的細胞；S2)將所述擴增后的細胞接種于培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)，得到內皮祖細胞；所述培養(yǎng)基中包括堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子與微載體。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加堿性成纖維細胞生長因子與血管內皮生長因子促進細胞生長，同時添加比表面積大的微載體，提高了單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率，簡化了細胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，重現(xiàn)性好，培養(yǎng)基利用率高，并且也簡化了細胞收獲過程，勞動強度小，培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積小。

技術領域

本發(fā)明屬于細胞工程技術領域，尤其涉及一種內皮祖細胞的培養(yǎng)方法。

背景技術

內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，通常分布在人的外周血、臍帶血以及骨髓中，參與新生血管的形成，在組織工程學中經(jīng)常會使用到血管內皮細胞對血管損傷進行修復。

血管損傷性疾病具有高發(fā)病率和死亡率的特點。受損內皮的有效修復和新生血管生成是這類疾病的治療關鍵。當內皮完整性破壞，內皮細胞(endothelial cells，ECs)從鄰近血管中增殖和遷移，促使受損血管內皮修復。以往認為這是新血管形成的唯一方式。然而，這種血管形成的傳統(tǒng)觀念目前正面臨挑戰(zhàn)。Asahara等第一個描述了骨髓來源的細胞群體有助于新血管形成，并命名這一細胞群為內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。相對于血管形成，來源于骨髓并增殖和分化成熟的EPCs形成的新血管被定義為血管發(fā)生。因此，EPCs被認為是治療血管性疾病的新方法。

現(xiàn)有技術培養(yǎng)內皮祖細胞通常都是通過二維貼壁培養(yǎng)，也就是通過培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶在平面進行培養(yǎng)，而這種培養(yǎng)方法首先細胞獲得率較低，耗費大量的人工與場地，耗費大量的培養(yǎng)基，并且得到的細胞容易分化，質量較差。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種大規(guī)模內皮祖細胞的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明提供了一種內皮祖細胞的培養(yǎng)方法，包括：

S1)將單個核細胞進行貼壁培養(yǎng)，消化后，得到擴增后的細胞；

S2)將所述擴增后的細胞接種于培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)，得到內皮祖細胞；所述培養(yǎng)基中包括堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子與微載體。

優(yōu)選的，所述步驟S2)培養(yǎng)基中擴增后的細胞密度為1×10⁴～1×10⁶cells/ml。

優(yōu)選的，所述步驟S2)培養(yǎng)基中堿性成纖維細胞生長因子與血管內皮生長因子的濃度各自獨立地為10～50ng/ml。

優(yōu)選的，所述步驟S2)培養(yǎng)基中堿性成纖維細胞生長因子與血管內皮生長因子的濃度各自獨立地為10～30ng/ml。

優(yōu)選的，所述步驟S2)培養(yǎng)基中微載體的濃度為0.001～0.02g/ml。

優(yōu)選的，所述步驟S2)中培養(yǎng)的溫度為36℃～37℃，CO₂的體積濃度為3％～10％。

優(yōu)選的，所述步驟S2)中培養(yǎng)具體為：

10～20轉/分鐘，培養(yǎng)1～3h，然后25～35轉/分鐘培養(yǎng)至第2天，補加培養(yǎng)基，再以40～60轉/分鐘進行培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述步驟S2)中培養(yǎng)具體為：

13～18轉/分鐘，培養(yǎng)1.5～2.5h，然后28～32轉/分鐘培養(yǎng)至第2天，補加培養(yǎng)基，再以45～55轉/分鐘進行培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述補加培養(yǎng)基的量為原始培養(yǎng)基體積的1/10～1/5。