[發明專利]鴨瘟病毒gE基因CT區域無痕缺失株DPV CHv-gEΔCT及其構建方法

有效

• 申請號: 201811599499.7
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109486774B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 程安春;劉田;秦旭東;汪銘書
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 郭艷艷;傅曉

本發明提供了一種鴨瘟病毒gE基因CT區域無痕缺失株DPV CHv?gEΔCT及其構建方法。本發明利用GS1783大腸桿菌菌株及pEPkan?S質粒，在細菌人工染色體重組鴨瘟病毒拯救系統平臺上經兩次同源重組缺失鴨瘟病毒gE基因CT區域，再經過細胞內自發同源重組方法缺失MiniF元件，首次完成了無外源堿基和MiniF元件殘留的鴨瘟病毒無痕缺失株的構建。本發明技術方案解決了缺失鴨瘟病毒基因時在缺失位點殘留堿基的問題并缺失了MiniF元件，為準確探究鴨瘟病毒基因功能及減毒活疫苗的構建提供了充分的技術支持。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種鴨瘟病毒gE基因CT區域無痕缺失株DPV CHv-gEΔCT及其構建方法。

背景技術

細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)是一種新發展起來的DNA載體系統，它具有容量大、遺傳特性穩定、易于操作等優點，在基因文庫構建和基因功能分析等方面有廣泛的應用。將完整病毒基因組DNA分子插入BAC載體，利用該載體編碼的最小生育力因子復制子(Minimal fertility factor replicon，Mini-F)獲得分子克隆化病毒，并結合大腸桿菌中成熟的基因定位修飾技術，從而實現在原核系統中病毒基因的缺失及外源基因的插入。目前較為常用的大腸桿菌基因定位修飾技術主要包括Red/ET介導的同源重組技術、RecA蛋白介導的同源重組技術、Cre/loxP介導的同源重組技術以及Tn轉座子介導的隨機插入和突變技術。利用分子克隆化技術手段現已獲得成熟的細菌人工染色體鴨瘟病毒拯救系統平臺，同時利用大腸桿菌基因定位修飾Red/ET介導的同源重組技術可在細菌人工染色體鴨瘟病毒拯救系統平臺上進行鴨瘟病毒基因的缺失和外源基因的插入，該成果極大的推動了鴨瘟病毒基因功能的研究進程。

Red/ET介導的同源重組技術是基于λ-噬菌體Red操縱子(Redα/Redβ/Redγ)和Rac噬菌體RecE/RecT同源重組酶的同源重組打靶技術。該技術操作簡單、快速、高效，廣泛應用于基因缺失、突變工作。但是利用該操作技術進行基因缺失、突變會在缺失或突變位點殘留約80bp左右外源堿基序列(FRT位點)，該位點的殘留將影響基因功能的準確分析。MiniF元件作為維持BAC載體復制的最小生育力因子復制子，主要由調控BAC復制起點(oriS)的repE、repF基因、調控復制子分配的sopA、sopB基因以及編碼著絲粒區域的sopC基因構成。為完成細菌抗性篩選及BAC標記篩選，MiniF元件加入了抗性篩選基因和熒光標記基因。MiniF元件插入病毒基因組，增加基因組長度，對病毒復制產生不確定影響。同時MiniF元件作為細菌序列在病毒基因組上殘留，不利于減毒活疫苗的開發和許可。因此解決堿基殘留問題并去除MiniF元件獲得無痕基因缺失株，已成為探究鴨瘟病毒基因缺失方法的重點。

鴨瘟(Duck Plague，DP)是由α-皰疹病毒亞科中鴨瘟病毒(Duck Plague virus,DPV)引起的鴨、鵝等水禽的急性接觸性高度致死性傳染病。該病首先由荷蘭報道，隨即在我國華南、華中和華東等養鴨業較為發達的地區流行，給我國的養鴨業造成了嚴重的經濟損失。因此深入了解鴨瘟病毒基因功能、加強對鴨瘟疫病的研究對確保我國養鴨業健康、可持續發展尤為重要。

鴨瘟病毒DPV-CHv株基因組DNA全長162175bp，包含78個開放閱讀框，可編碼參與鴨瘟病毒生命周期的結構蛋白和非結構蛋白，其中結構蛋白主要包括衣殼蛋白、皮層蛋白和囊膜蛋白。囊膜蛋白為糖基化蛋白，包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、gN十二種。糖蛋白具有介導病毒吸附、進入敏感細胞以及促進病毒在細胞間傳播的功能，同時攜帶抗原決定簇，可誘導動物機體免疫系統對病毒的識別并造成組織的病理損傷，因此探究囊膜糖蛋白在鴨瘟病毒生命周期中的作用對深入探究鴨瘟病毒基因功能及開展鴨瘟疫病防治工作至關重要。