[發明專利]鴨瘟病毒gE基因CT區域無痕缺失株DPV CHv-gEΔCT及其構建方法

有效

• 申請號: 201811599499.7
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109486774B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 程安春;劉田;秦旭東;汪銘書
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 郭艷艷;傅曉

1.鴨瘟病毒gE基因CT區域無痕缺失株DPV CHv-gEΔCT的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將pBAC-DPV質粒轉化到GS1783大腸桿菌感受態中，獲得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制備GS1783-pBAC-DPV感受態；

(2)以pEPkan-S為模板，以GS1783-BAC-gEΔCT-F和GS1783-BAC-gEΔCT-R作為引物，通過PCR方法擴增包含I_SceI酶切位點和Kana元件的堿基片段以及gE基因CT區域上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-CT，切膠回收獲得I_SceI-Kana-CT片段；

(3)將I_SceI-Kana-CT片段轉化到GS1783-pBAC-DPV感受態中，篩選，獲得陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-CT-Kana；

(4)將陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-CT-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，制備GS1783-pBAC-DPV-gEΔCT感受態；

(5)以pEPkan-S為模板，以GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R作為引物，通過PCR方法擴增包含I_SceI酶切位點和Kana元件的堿基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp處和位于MiniF元件ori2基因下游290bp處的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切膠回收獲得I_SceI-Kana-MiniF片段；引物序列為：

GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’；

GS1783-MiniF-R:5’-ATCGTTTTCGTTACCGCTTGCAGGCATCAGACAGAACACTACTTCCTATtagggataacagggtaatcgat-3’；

PCR擴增體系為：ddH₂O 22μl、Max DNA Polymerase 25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；PCR擴增條件為：98℃預變性2min、98℃變性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30個循環，最后72℃延伸10min；

(6)以CHv基因組為模板，以CHv-UL23-F和CHv-UL23-R作為引物，通過PCR方法擴增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重疊25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp處的同源臂片段，切膠回收獲得UL23-MiniF片段；

(7)以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段為模板，進行PCR融合反應，然后以融合片段為模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作為引物進行PCR擴增獲得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；

(8)將I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段轉化到GS1783-pBAC-DPV-gEΔCT感受態中，經抗生素篩選和PCR鑒定，獲得陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔCT-UL23-Kana；

(9)將陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔCT-UL23-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，獲得陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔCT-UL23；

(10)從陽性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔCT-UL23中提取pBAC-DPV-gEΔCT-UL23質粒，將pBAC-DPV-gEΔCT-UL23質粒轉染DEF細胞，通過克隆篩選，獲得gE基因CT區域無痕缺失株DPV CHv-gEΔCT。

2.根據權利要求1所述的鴨瘟病毒gE基因CT區域無痕缺失株DPV CHv-gEΔCT的構建方法，其特征在于，步驟(2)和步驟(6)中PCR擴增體系為：ddH₂O 22μl、Max DNAPolymerase 25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；PCR擴增條件為：98℃預變性2min、98℃變性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30個循環，最后72℃延伸10min。