[發明專利]一種單細胞全基因組測序的方法

在審

• 申請號: 201811598380.8
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN111363795A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 白凈衛;劉冊
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

本發明提供了一種單細胞全基因組測序的方法，及一種擴增方法在構建基因文庫、單分子測序中的用途，所述的擴增方法包括將核酸與核酸聚合酶、隨機引物接觸進行核酸與鏈的多重置換擴增。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種單細胞全基因組測序的方法及一種擴增方法在單分子測序中的用途。

背景技術

單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術。其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組之后通過外顯子捕獲進而高通量測序用于揭示細胞群體差異和細胞進化關系。

單細胞全基因組擴增是指在單細胞水平對全基因組進行擴增的新技術,其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增,獲得高覆蓋率的完整的基因組后進行高通量測序,用于揭示細胞異質性。目前，WGA方法主要包括引物延伸預擴增(primerextension pre-amplification PCR，PEP-PCR)、簡并寡核苷酸引物PCR(degenerateoligo-nucleotide primed PCR，DOP-PCR)、多重置換擴增(multiple displacementamplification，MDA)、多次退火環狀循環擴增(multiple annealing and looping-basedamplification cycles，MALBAC)等

專利CN101213311A公開了利用滾環擴增法擴增和克隆單個DNA分子，被擴增的DNA足夠無本底，無需進一步純化而能將其直接用于測序。

專利CN104630202A公開了一種能夠減小微量核酸物質整體擴增時產生偏倚的擴增方法，包括將所述核酸物質隨機分散到若干互不連通的獨立反應體系中，擴增使用的引物序列中包含3-20個隨機堿基，隨機堿基隨機選自A、G、C、T中的二個、三個或四個。使用該方法相對于微量核酸物質在大體系中的擴增方法，擴增偏倚降低降低1個數量級以上，擴增結果能夠準確反應原始核酸物質中的定量信息，可允許更多的擴增循環，從而獲得更多的產物。

專利CN104560950A公開了一種基于MDA的全基因組擴增的方法，及擴增試劑盒，并將獲得的純化的DNA用于二代測序。

目前尚未存在單分子測序單細胞全基因組測序中的應用。

發明內容

本發明提供了一種單細胞全基因組測序的方法，所述的方法包括如下步驟：

獲取單細胞，提取單細胞中的核酸；

擴增所述提取的單細胞中的核酸得到1-100kb的長核酸序列；

對所述的長核酸序列進行單分子測序。

優選的，所述單細胞的獲取方法選自有限稀釋法、顯微操作法、熒光流式分選法、微液滴技術、激光顯微切割技術或直接采用毛細管挑取單個細胞。

在本發明的一個具體實施方式中，所述的獲取單細胞的方法為微液滴技術。

在本發明的另一個具體實施方式中，所述的獲取單細胞的方法為直接采用毛細管挑取單個細胞。

優選的，所述擴增的方法包括將核酸與核酸聚合酶、隨機引物接觸進行核酸與鏈的多重置換擴增。

更優選的，所述擴增的方法包括恒溫條件下，將核酸與核酸聚合酶、隨機引物接觸進行核酸與鏈的多重置換擴增。

在本發明的一個具體實施方式中，所述擴增的方法包括將單細胞中的基因組DNA囊封在微滴中，然后進行恒溫條件下，將囊封在微滴中的核酸與核酸聚合酶、隨機引物接觸進行核酸與鏈的多重置換擴增。