[發(fā)明專利]一種單細(xì)胞全基因組測(cè)序的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811598380.8
• 申請(qǐng)日: 2018-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN111363795A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白凈衛(wèi);劉冊(cè)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京領(lǐng)科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

1.一種單細(xì)胞全基因組測(cè)序的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：

獲取單細(xì)胞，提取單細(xì)胞中的核酸；

擴(kuò)增所述提取的單細(xì)胞中的核酸得到1-100kb的長核酸序列；

對(duì)所述長核酸序列進(jìn)行單分子測(cè)序；

其中，所述擴(kuò)增的方法包括將核酸與核酸聚合酶、隨機(jī)引物接觸進(jìn)行核酸與鏈的多重置換擴(kuò)增。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增的方法包括恒溫條件下，將核酸與核酸聚合酶、隨機(jī)引物接觸進(jìn)行核酸與鏈的多重置換擴(kuò)增。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述長核酸序列選自單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈RNA、雙鏈RNA/DNA雜交體、部分雜交的DNA以及RNA，或者，經(jīng)過酶學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)方法處理過的DNA或RNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述單分子測(cè)序選自基于光信號(hào)的單分子測(cè)序或基于電信號(hào)的單分子測(cè)序；優(yōu)選的，所述單分子測(cè)序?yàn)榧{米孔測(cè)序、單分子熒光實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的單細(xì)胞獲取的方法選自有限稀釋法、顯微操作法、熒光流式分選法、微液滴技術(shù)、激光顯微切割技術(shù)或直接采用毛細(xì)管挑取單個(gè)細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的單分子測(cè)序包括構(gòu)建長片段測(cè)序文庫，將構(gòu)建的長片段測(cè)序文庫進(jìn)行納米孔測(cè)序或單分子熒光實(shí)時(shí)測(cè)序。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：

獲取單細(xì)胞，提取單細(xì)胞中的核酸；所述的獲取單細(xì)胞的方法選自有限稀釋法、顯微操作法、熒光流式分選法、微液滴技術(shù)、激光顯微切割技術(shù)或直接采用毛細(xì)管挑取單個(gè)細(xì)胞，所述的提取單細(xì)胞中的核酸包括對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解，提取基因組DNA；

擴(kuò)增所述單細(xì)胞中的核酸得到1-100kb的長核酸序列；所述的擴(kuò)增包括將六聚體隨機(jī)引物(N6)結(jié)合到基因組DNA上，聚合酶結(jié)合到六聚體隨機(jī)引物3’末端進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，被置換下來的單鏈繼續(xù)結(jié)合引物，進(jìn)行下一級(jí)的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)；獲得帶有多分枝狀結(jié)構(gòu)的長核酸產(chǎn)物；利用S1核酸酶消化所述多分枝狀擴(kuò)增產(chǎn)物，得到長度為1-100kb的線性雙鏈平末端核酸產(chǎn)物，所述的線性雙鏈平末端核酸產(chǎn)物為長核酸序列；

對(duì)所述長核酸序列進(jìn)行單分子測(cè)序；所述的單分子測(cè)序包括將獲得的1-100kb的長核酸序列進(jìn)行構(gòu)建長片段測(cè)序文庫；將所述的長片段測(cè)序文庫中的雙鏈DNA在解旋酶的作用下解鏈為單鏈DNA，解旋的同時(shí)單鏈DNA在電壓的驅(qū)動(dòng)下通過嵌在膜上的納米孔；單鏈DNA上四種不同的堿基通過納米孔時(shí)會(huì)形成不同的阻遏電流，通過記錄阻遏電流的大小，確定DNA的堿基序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：

獲取單細(xì)胞，提取單細(xì)胞中的核酸；所述的獲取單細(xì)胞的方法選自有限稀釋法、顯微操作法、熒光流式分選法、微液滴技術(shù)、激光顯微切割技術(shù)或直接采用毛細(xì)管挑取單個(gè)細(xì)胞，所述的提取單細(xì)胞中的核酸包括將單細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解，提取基因組DNA；

擴(kuò)增所述單細(xì)胞中的核酸得到1-100kb的長核酸序列；所述的擴(kuò)增包括將六聚體隨機(jī)引物(N6)結(jié)合到基因組DNA上，DNA聚合酶結(jié)合到六聚體隨機(jī)引物3’末端進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，被置換下來的單鏈繼續(xù)結(jié)合引物，進(jìn)行下一級(jí)的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)；獲得帶有多分枝狀結(jié)構(gòu)的長核酸產(chǎn)物；利用S1核酸酶消化所述多分枝狀擴(kuò)增產(chǎn)物，得到長度為1-100kb的線性雙鏈平末端核酸產(chǎn)物，所述的線性雙鏈平末端核酸產(chǎn)物為長核酸序列；

對(duì)所述長核酸序列進(jìn)行單分子測(cè)序；所述的單分子測(cè)序包括將獲得的1-100kb的長核酸序列進(jìn)行構(gòu)建長片段測(cè)序文庫；將DNA聚合酶和長片段測(cè)序文庫中的DNA單分子鏈固定在小孔中，加入熒光標(biāo)記的游離的脫氧核苷酸，當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入所述文庫中DNA鏈時(shí)，顯微鏡探測(cè)熒光信號(hào)。