[發(fā)明專利]一種具有熱恢復(fù)特性的新型殼聚糖酶CsnM及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811596664.3
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109486804B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李尚勇;韓彥弢;周宇
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/56;C12P19/26;C12P19/12
• 代理公司: 濟(jì)南知來知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37276
• 代理人: 于志波;曹麗

1.一種新型殼聚糖酶CsnM，其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的新型殼聚糖酶CsnM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如權(quán)利要求1所述的新型殼聚糖酶CsnM的制備方法，步驟如下：

將CsnM的產(chǎn)酶序列以限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I為酶切位點，設(shè)計重組引物如下： 正向引物：SEQ ID NO .3， 反向引物：SEQ ID NO .4； PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，72℃延伸5min，4℃穩(wěn)定15min；

PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI進(jìn)行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的PCR產(chǎn)物，pET22b(+)質(zhì)粒DNA同樣用限制性內(nèi)切酶Nco I和XhoI進(jìn)行雙酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切后的產(chǎn)物片段，酶切所用酶和底物反應(yīng)體系均參照大連寶生物提供的產(chǎn)品說明操作；

雙酶切處理的PCR產(chǎn)物和pET-22b(+)質(zhì)粒載體參照DNA連接酶說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，涂布在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基固體平板上，含有50μg/mL氨芐青霉素，37℃溫箱中培養(yǎng)12-16小時后，挑取單克隆，將單克隆轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，含有50μg/mL氨芐青霉素，轉(zhuǎn)速 為180rpm的37℃搖床中培養(yǎng)過夜，將單克隆進(jìn)行序列測定，選擇陽性克隆，并將其命名為pET22b-csnM，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，將重組大腸菌 株命名為BL21(DE3)/pET22b-csnM，保存在-80℃?zhèn)溆茫?/p>

所述殼聚糖酶CsnM的產(chǎn)酶基因csnM來源于海洋細(xì)菌Pseudoalteromonase sp .SY39；

將重組菌株BL21(DE3)/pET22b-csnM在100mL的LB液體培養(yǎng)基中，含有50μg/mL氨芐青霉素，在37℃搖床中180rpm震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6，加入終濃度為0.1mM的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在20℃誘導(dǎo)20h；

發(fā)酵停止后，12000rpm離心10min，棄菌體，收集上清液；

發(fā)酵上清液上樣于10mL鎳離子親和層析柱，上樣流速為5mL/min，利用10mM咪唑洗脫，去除雜蛋白，再利用150mM的咪唑洗脫，收集洗脫組分；

將活性成分透析去除咪唑，分裝儲存在-20℃?zhèn)溆茫?/p>

通過鎳離子一步親和純化。

4.如權(quán)利要求1所述的殼聚糖酶在降解殼聚糖中的應(yīng)用。

5.一種降解殼聚糖的方法，其特征是，所述步驟如下：100μL殼聚糖酶液加入900μL0.3％殼聚糖底物，20mM醋酸-醋酸鈉，反應(yīng)，所選用的殼聚糖酶為權(quán)利要求1所述的殼聚糖酶。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是，降解條件中反應(yīng)溫度為0～70℃。

7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是，降解條件中反應(yīng)pH為4.9～7.1。