[發明專利]人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體及抗原捕獲ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201811596382.3
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN110540972B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 胡征
• 申請（專利權）人: 湖北云璐生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;C07K14/195;C12N15/31;C12N15/70;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒

1.一種產生人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于：所述產生人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株是由中國典型培養物保藏中心保藏的保藏號是保藏編號CCTCC NO：C2017216的雜交瘤細胞株Lp-2#。

2.一種產生人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：

1）以重組人嗜肺軍團菌表面蛋白PAL為抗原，對8周齡的BALB/c小鼠進行免疫后，采用間接ELISA方法檢測抗血清效價；

2）SP2/0骨髓瘤細胞的復蘇和培養；

3）制備飼養細胞；

4）制備免疫脾細胞懸液；

5）制備SP2/0骨髓瘤細胞懸液；

6）細胞融合；

7）陽性克隆的篩選和克隆化培養，以人嗜肺軍團菌菌體為包被抗原，采用間接ELISA法檢測；用酶聯檢測儀測定OD₄₅₀，滿足P/N值＞2.1為陽性；選取連續陽性的克隆孔進行2-3次亞克隆，篩選出單克隆雜交瘤細胞；對單克隆雜交瘤細胞進行擴大培養，獲取含單克隆抗體的細胞培養液上清；以呼吸道病原菌分別包被酶標板，對所篩抗體的特異性進行ELISA檢測，淘汰與這些病原體有陽性反應的單克隆抗體，篩選出合格的細胞株；所述呼吸道病原菌為人肺炎支原體、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、鮑曼不動桿菌、副流感嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、人肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希菌以及假絲酵母菌。

3.根據權利要求2所述的產生人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于：所述步驟1）中重組人嗜肺軍團菌表面蛋白PAL的制備過程是：

1.1）人嗜肺軍團菌PAL基因的克隆表達

對人嗜肺軍團菌表面蛋白PAL基因進行生物信息學分析，結合GC含量、密碼子偏愛性、mRNA二級結構、RNA不穩定基序以及mRNA自由能穩定性，優化人嗜肺軍團菌表面蛋白PAL基因的DNA編碼序列，同時在人嗜肺軍團菌表面蛋白PAL基因的5’引入酶切位點NdeI、在人嗜肺軍團菌表面蛋白PAL基因的3’端引入終止信號TAA和酶切位點EcoRI后化學合成全基因序列后連于載體pUC57上，記為PAL’；將含有該段人工合成的DNA片段的載體pUC57用NdeI及EcoRI進行雙酶切后按常規方法回收目的片段，備用；同時采用NdeI及EcoRI對載體pET-28a（+）進行雙酶切，并按常規方法將經雙酶切后獲得的PAL’基因連入pET-28a（+）載體中，并轉化大腸桿菌TOP10，構建pET-PAL’表達載體；經酶切和序列測定證實表達載體構建無誤；該載體表達重組PAL-His融合蛋白；

1.2）人嗜肺軍團菌PAL蛋白的純化

鑒定正確的陽性克隆菌培養后提取質粒，按常規技術轉入感受態E.coliBL21（DE3）plysS中，轉化完成后將菌液涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常規方法篩選表達菌株后培養，純化。

4.一種人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體，其特征在于：所述人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體是由權利要求1所述的雜交瘤細胞株Lp-2#分泌的單克隆抗體。

5.一種如權利要求4所述的人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

對篩選得到的陽性單克隆雜交瘤細胞進行擴大培養；常規腹水體內誘生方法制備單抗腹水，收集單抗腹水并用Protein A親和層析法對腹水進行純化，得到人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體Lp-2#。

6.根據權利要求4所述的人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體在制備檢測人嗜肺軍團菌的試劑中的應用。

7.根據權利要求4所述的人嗜肺軍團菌表面蛋白單克隆抗體在制備檢測人嗜肺軍團菌表面蛋白捕獲ELISA試劑盒中的應用。