[發明專利]去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備

在審

• 申請號: 201811596345.2
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN111363716A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 譚小軍;盧永娟;黃潔瓊
• 申請（專利權）人: 譚小軍;盧永娟;黃潔瓊
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;A61L31/00;A61L31/16
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備，具體包括以下步驟：自體子宮內膜干細胞的分離培養，去細胞羊膜載體的制備和保存以及去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備。本發明克服了中重度宮腔粘連患者宮腔鏡手術機械性分離宮腔粘連，術后放置宮內節育器或防粘連材料，于術后給予雌激素促進內膜生長所不能實現的內膜功能性修復，且極易發再次粘連等缺陷。本發明中去細胞羊膜載體具有良好的抗粘連能力、生物相容性、可降解性及安全性，自體子宮內膜干細胞作為治療嚴重子宮內膜損傷的活性成分，可分泌生長因子改善局部微環境及免疫調節，促進受損子宮內膜修復，增加內膜厚度及局部血管密度。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，具體涉及去細胞羊膜支架復合自體子宮內膜干細胞的制備。

背景技術

子宮內膜由內到外分為功能層和基底層，在性激素作用下發生周期性增殖、剝脫，同時，在雌激素作用下，基底層腺體斷端處上皮細胞增生形成新的功能層，覆蓋子宮體腔達到修復創面的作用。因此，即使每個月經周期都有子宮內膜的壞死剝脫，子宮前后壁互相緊貼也不會形成粘連。而在重度宮腔粘連患者中，基底層損傷、腺體消失，導致上皮細胞、新生血管形成受阻；同時，在創面修復過程中，成纖維細胞生成增加，細胞外基質堆積，導致局部纖維結締組織增殖，子宮前后壁相互貼附，導致粘連形成。因此，抑制創面滲出，避免創面互相接觸、促進子宮內膜生長修復成為術后預防宮腔再粘連形成的主要手段。

羊膜是一種半透明膜，其獨有的結構可阻止某些物質通過，保證包裹內組織正常營養供應，而且具有抗粘連能力、組織相容性好及可降解等特性，作為一種生物屏障廣泛應用于燒傷、外周神經修復等外科領域。特別是在眼科領域，羊膜移植已成為一種較為成熟的治療眼表損傷、預防術后粘連形成的常見術式。最近有研究表明，宮腔粘連術后用人羊膜覆蓋創面能夠顯著降低宮腔再粘連的發生率，但無法促進受損的基底層再生。

干細胞是一類具有自我更新及多向分化潛能的細胞，干細胞移植已經應用于多種疾病的治療。大量研究表明，子宮內膜存在干細胞，深入子宮基底層的損傷，會引起干細胞的丟失或功能異常，導致子宮內膜再生失敗，因此子宮內膜干細胞移植治療有望成為宮腔粘連患者更好的選擇。近來有研究證實，子宮內膜干細胞宮腔注射后給與激素替代治療，能增加子宮內膜厚度，但局部注射后很難在損傷局部定位，影響療效。

發明內容

本發明的目的就在于克服上述缺陷，提供去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備。

本發明的技術方案是：

一種去細胞羊膜載體負載自體子宮內膜干細胞的制備方法，該方法包括以下步驟：

（1）自體子宮內膜干細胞的分離培養；

（2）去細胞羊膜載體的制備和保存；

（3）去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備。

所述步驟（1）中自體子宮內膜干細胞的分離培養主要是：搔刮采集少量子宮內膜組織，在無菌的環境下進行操作，用含1%青鏈霉素的生理鹽水反復沖洗去除血污，剪碎至直徑＜1毫米；加入約組織的3倍體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，混勻，置37℃恒溫搖床中振蕩消化30分鐘；加入含有10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化；吹打細胞懸液后過濾400目篩網，收集子宮內膜干細胞；加入含有10%FBS的DMEM/F12培養基重懸，置于37℃、5% CO₂培養箱中培養；24小時后換液，每隔2天換液，待細胞融合度達到90%左右時，行傳代培養。