[發明專利]去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備

在審

• 申請號: 201811596345.2
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN111363716A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 譚小軍;盧永娟;黃潔瓊
• 申請（專利權）人: 譚小軍;盧永娟;黃潔瓊
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;A61L31/00;A61L31/16
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備，該方法包括以下步驟：

（1）自體子宮內膜干細胞的分離培養；

（2）去細胞羊膜載體的制備和保存；

（3）去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備。

2.所述步驟（1）中自體子宮內膜干細胞的分離培養主要是：搔刮采集少量子宮內膜組織，在無菌的環境下進行操作，用含1%青鏈霉素的生理鹽水反復沖洗去除血污，剪碎至直徑＜1毫米；加入約組織的3倍體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，混勻，置37℃恒溫搖床中振蕩消化30分鐘；加入含有10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化；吹打細胞懸液后過濾400目篩網，收集子宮內膜干細胞；加入含有10%FBS的DMEM/F12培養基重懸，置于37℃、5% CO₂培養箱中培養；24小時后換液，每隔2天換液，待細胞融合度達到90%左右時，行傳代培養。

3.所述步驟（2）中去細胞羊膜載體的制備和保存主要是：收集術前四項陰性的剖腹產婦的胎盤組織，無菌操作下，沖洗胎盤上的血跡及污物，在羊膜與絨毛膜之間鈍性分離；獲得光滑、半透明的羊膜后，將羊膜上皮細胞面朝上平鋪于培養皿中，用含1%青鏈霉素的生理鹽水反復沖洗去除血污；將羊膜剪裁為10cm培養皿大小的羊膜片，上皮細胞面朝上放置在10cm培養皿中；每皿加入10ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，于37℃消化2小時，無菌生理鹽水沖洗至鏡下觀察無上皮細胞殘留，制得去細胞羊膜載體；于－60℃下預凍3小時，然后在－70℃~－80℃下冷阱干燥24小時，取出于陰涼干燥處保存。

4.所述步驟（3）中去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的制備：取凍干去細胞羊膜載體置于紫外線照射0.5小時消毒，加入5毫升 DMEM/F12基礎培養基，放置在37°恒溫培養箱中預培養1小時，鏡下觀察羊膜無雜質；生理鹽水浸洗3遍，吸棄舊液，將培養皿置于超凈工作臺風干0.5小時，使羊膜完全貼附于皿底；按照1*10⁵/cm²的密度接種子宮內膜干細胞，37℃、5% CO₂培養箱中培養24小時。

5.根據權利要求1得到的去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞的應用，其特征在于去細胞羊膜載體復合自體子宮內膜干細胞貼附固定于宮腔粘連分離術后的創傷內膜表面，防治宮腔再粘連，促進受損子宮內膜的生長修復。