[發(fā)明專利]人肺炎支原體表面蛋白單克隆抗體及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811596147.6
• 申請(qǐng)日: 2018-12-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110540971A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-12-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡征
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北諾美華抗體藥物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/20
• 分類號(hào): C12N5/20;C12N15/06;C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 42001 武漢宇晨專利事務(wù)所
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>

1.一種產(chǎn)生人肺炎支原體表面蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于：所述產(chǎn)生人肺炎支原體表面蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株是由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)是保藏編號(hào)CCTCC NO：C2017210的雜交瘤細(xì)胞株Mp-13#。

2.一種產(chǎn)生人肺炎支原體表面蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟：

1)重組人肺炎支原體P1蛋白的制備：

對(duì)人肺炎支原體表面蛋白P1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，所述人肺炎支原體表面蛋白P1的NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的accession number為AAK92040.1，結(jié)合GC含量、密碼子偏愛(ài)性、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、RNA不穩(wěn)定基序以及mRNA自由能穩(wěn)定性，優(yōu)化人肺炎支原體表面蛋白P1的DNA編碼序列，同時(shí)在人肺炎支原體表面蛋白P1的DNA編碼序列的5’引入酶切位點(diǎn)NdeI、在人肺炎支原體表面蛋白P1的DNA編碼序列的3’端引入終止信號(hào)TAA和酶切位點(diǎn)EcoRI后化學(xué)合成全基因序列，所述化學(xué)合成的全基因序列連于載體pUC57上，記為P1’；將P1’按常規(guī)方法克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)，用IPTG誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)，用Ni2+親和層析法純化可溶性重組人肺炎支原體P1蛋白；

2)篩選抗人肺炎支原體表面蛋白陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株：

a)制備免疫脾細(xì)胞：以步驟1)所制重組人肺炎支原體P1蛋白為抗原，免疫8周齡的BALB/c小鼠5只，設(shè)2只不作免疫小鼠做陰性對(duì)照；初次免疫抗原加等量弗氏完全佐劑充分乳化后，背部皮下多點(diǎn)注射免疫小鼠，100μg/小鼠；之后間隔三周用相同劑量抗原與福氏不完全佐劑充分乳化后腹腔注射進(jìn)行第二次免疫，以后間隔2周用相同劑量抗原與福氏不完全佐劑充分乳化后腹腔注射進(jìn)行第三次免疫；第三次免疫15天后尾靜脈采血，檢測(cè)抗血清效價(jià)；取小鼠脾臟，用RPMI-1640洗液沖洗后，用吸有5ml RPMI-1640培養(yǎng)基注射器針頭穿刺脾臟小心的洗出脾細(xì)胞，然后過(guò)篩，使脾細(xì)胞盡可能都通過(guò)網(wǎng)孔擠壓到溶液中，將脾細(xì)胞懸液移入離心管中，1100rpm離心5min，棄上清，離心洗滌兩次；用RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕將脾細(xì)胞重懸，計(jì)數(shù)，備用；

b)細(xì)胞融合：將含1×10⁸個(gè)脾細(xì)胞的懸液和含1×10⁷個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的懸液混合，補(bǔ)加培養(yǎng)基洗液至40ml，充分混勻；1200rpm離心5分鐘，棄去上清；使細(xì)胞團(tuán)塊松散均勻呈糊狀；取出已配好的50％PEG、RPMI-1640洗液，放在37℃水浴中，預(yù)溫備用；所述PEG是MW1450；吸取50％的PEG 0.8ml，緩慢加入離心管邊加邊攪拌，時(shí)間控制在60秒±5秒；然后再用60秒的時(shí)間逐漸加入40ml預(yù)熱好的RPMI-1640洗液，使PEG稀釋而失去促融作用；室溫離心融合細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清；加入HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸、重懸沉淀細(xì)胞；將融合細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，50μl/孔，然后將培養(yǎng)板置37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

c)陽(yáng)性克隆的篩選和克隆化培養(yǎng)：融合后第3天開(kāi)始，每天觀察各孔細(xì)胞生長(zhǎng)情況，若有污染，立即用疊氮鈉處理；融合后第7d用HT培養(yǎng)液全換液；換液后第二天，吸取出現(xiàn)克隆的孔上清用于特異性檢測(cè)；將檢測(cè)到有強(qiáng)陽(yáng)性的孔，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆和克隆，經(jīng)過(guò)3次克隆化操作后，所有的克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率為100％，即可確定已獲得了分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

3.一種人肺炎支原體表面蛋白單克隆抗體，其特征在于：所述人肺炎支原體表面蛋白單克隆抗體是由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株Mp-13#分泌的單克隆抗體。