[發(fā)明專利]一種同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的試劑盒和方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811596144.2
• 申請(qǐng)日: 2018-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN111363789A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建明;倪雯;姚溯;周云俠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6841
• 分類號(hào): C12Q1/6841;G01N33/53;G01N33/68
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;宋靜娜

本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的試劑盒，所述試劑盒包括固定液、胃蛋白酶、雜交液、封閉液、生物素化地高辛、熒光一抗、熒光二抗和DAPI復(fù)染封片劑；本發(fā)明還公開了一種同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的方法。采用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒和方法，能在同一組織或細(xì)胞水平同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)與RNA的共定位表達(dá)，通過熒光顯微鏡可直觀的觀察蛋白質(zhì)與RNA的表達(dá)情況。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物大分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的試劑盒和方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)免疫熒光技術(shù)是指用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法，用于檢測(cè)或定位各種抗原。

RNA FISH(RNA熒光原位雜交)技術(shù)是將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上一種報(bào)告分子(如生物素、地高辛)，利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)RNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析的過程。RNA FISH可提供RNA在組織細(xì)胞的空間表達(dá)信息。

但是目前，臨床上還不能在一個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的表達(dá)?，F(xiàn)有技術(shù)無法結(jié)合蛋白質(zhì)免疫熒光和RNA FISH技術(shù)，從而實(shí)現(xiàn)在同一組織或細(xì)胞水平同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)與RNA的共定位表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

基于上述問題，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的方法，采用該方法能在同一組織或細(xì)胞水平同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)與RNA的共定位表達(dá)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案包括以下內(nèi)容：

在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的試劑盒，所述試劑盒包括固定液、胃蛋白酶、雜交液、封閉液、生物素化地高辛、熒光一抗、熒光二抗和DAPI復(fù)染封片劑。

優(yōu)選地，所述固定液為4％(W/W)的多聚甲醛，其中含有1/1000(W/W)DEPC。

優(yōu)選地，所述胃蛋白酶的使用濃度為5ug/ml。

優(yōu)選地，所述雜交液含有0.01M PBS，0.05％(W/W)Tween，1％(W/W)羊血清和1％(W/W)BSA。

優(yōu)選地，所述封閉液含有0.01M PBS，0.1％(W/W)Tween，2％(W/W)羊血清和1％(W/W)BSA。

優(yōu)選地，所述生物素化地高辛為生物素化鼠抗地高辛。

優(yōu)選地，所述熒光一抗為Alexa647標(biāo)記的熒光一抗。

優(yōu)選地，所述熒光二抗為SABC-FITC標(biāo)記的熒光二抗。

在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)和RNA的方法，包括如下步驟：

(1)取細(xì)胞爬片室溫固定，固定液為4％(W/W)多聚甲醛，其中含有1/1000DEPC；

(2)暴露mRNA核酸片段：向步驟(1)所得細(xì)胞爬片上滴加檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，37℃或室溫消化，清洗；

(3)預(yù)雜交：干的雜交盒底部加甘油以保持濕度，按每張步驟(2)所得細(xì)胞爬片加40μL雜交液，恒溫箱40℃、2小時(shí)，之后吸取多余液體；

(4)雜交:用雜交液稀釋地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針，按每張步驟(3)所得細(xì)胞爬片加50μL雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開，蓋在切片上，恒溫箱40℃雜交過夜；

(5)雜交后洗滌：40℃水溫的2×SSC洗滌步驟(4)所得細(xì)胞爬片5分鐘×2次；0.5×SSC洗滌15分鐘×1次；0.2×SSC洗滌15分鐘×1次；

(6)封閉：向步驟(5)所得細(xì)胞爬片加入封閉液，在37℃反應(yīng)30分鐘；