[發明專利]一種同時檢測蛋白質和RNA的試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201811596144.2
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN111363789A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 李建明;倪雯;姚溯;周云俠
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;G01N33/53;G01N33/68
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;宋靜娜

1.一種同時檢測蛋白質和RNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括固定液、胃蛋白酶、雜交液、封閉液、生物素化地高辛、熒光一抗、熒光二抗和DAPI復染封片劑。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固定液為4％(W/W)的多聚甲醛，其中含有1/1000(W/W)DEPC。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述胃蛋白酶的使用濃度為5ug/ml。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述雜交液含有0.01M PBS，0.05％(W/W)Tween，1％(W/W)羊血清和1％(W/W)BSA。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述封閉液含有0.01M PBS，0.1％(W/W)Tween，2％(W/W)羊血清和1％(W/W)BSA。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述生物素化地高辛為生物素化鼠抗地高辛。

7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光一抗為Alexa647標記的熒光一抗。

8.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光二抗為SABC-FITC標記的熒光二抗。

9.一種同時檢測蛋白質和RNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)取細胞爬片室溫固定，固定液為4％(W/W)多聚甲醛，其中含有1/1000DEPC；

(2)暴露mRNA核酸片段：向步驟(1)所得細胞爬片上滴加檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，37℃或室溫消化，清洗；

(3)預雜交：干的雜交盒底部加甘油以保持濕度，按每張步驟(2)所得細胞爬片加40μL雜交液，恒溫箱40℃、2小時，之后吸取多余液體；

(4)雜交:用雜交液稀釋地高辛標記的寡核苷酸探針，按每張步驟(3)所得細胞爬片加50μL雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開，蓋在切片上，恒溫箱40℃雜交過夜；

(5)雜交后洗滌：40℃水溫的2×SSC洗滌步驟(4)所得細胞爬片5分鐘×2次；0.5×SSC洗滌15分鐘×1次；0.2×SSC洗滌15分鐘×1次；

(6)封閉：向步驟(5)所得細胞爬片加入封閉液，在37℃反應30分鐘；

(7)向步驟(6)所得細胞爬片滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃反應60min，避光；

(8)步驟(7)所得細胞爬片用PBS清洗后，熒光二抗用PBS稀釋，向細胞爬片滴加稀釋后的熒光二抗，之后37℃反應30分鐘；

(9)步驟(8)所得細胞爬片用PBS清洗后，加入免疫熒光直標熒光一抗孵育60min，37℃、避光；之后PBS清洗，再利用含DAPI染色劑封片，然后用熒光顯微鏡觀察細胞爬片，即得。