[發明專利]鏈格孢酚單甲醚的磁免疫熒光定量檢測方法

在審

• 申請號: 201811595181.1
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109799332A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 滿燕;潘立剛;靳欣欣
• 申請（專利權）人: 北京農業質量標準與檢測技術研究中心
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

1.鏈格孢酚單甲醚的磁免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、Fe₃O₄磁珠-AME單抗復合物溶液的制備；

B、CAT-AME復合物溶液的制備；

C、巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點溶液的制備；

D、不同濃度的AME標準品溶液的制備；

E、將不同濃度的AME標準品溶液分別與A制備的Fe₃O₄磁珠-AME單抗復合物溶液和B制備的CAT-AME復合物溶液混合孵育一段時間后，進行磁分離，將上清液轉移至離心管中，加入一定濃度的過氧化氫溶液，孵育一段時間后，將反應混合物加入C制備的的巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點溶液中，避光反應一段時間后，檢測產物的熒光強度，建立反映熒光強度與AME濃度之間關系的標準曲線；

F、將E中不同濃度的AME標準品溶液替換成待測樣品溶液，按照相同的方法進行檢測，將檢測到的熒光強度代入上述標準曲線，計算得出待測樣品溶液中AME含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，A具體為：

A1、Fe₃O₄磁珠的制備：5.4g FeCl₃·6H₂O和2.78g FeSO₄·7H₂O加入到100mL水中，80℃條件下攪拌20min；加入30％氨水8mL，繼續攪拌30min；用水和乙醇清洗后干燥，即得Fe₃O₄磁珠；

A2、Fe₃O₄磁珠的氨基化修飾：將100mg A1制備的磁珠在超聲條件下分散于25mL無水乙醇；加入200μL水和1mL APTES，室溫條件下孵育過夜；用水清洗后，將制備的氨基化磁珠復溶于8mL水中，得到氨基化的磁珠溶液；

A3、Fe₃O₄磁珠的醛基化修飾：取1mL A2制備的磁珠溶液復溶于1mL PB緩沖液中；加入0.5mL戊二醛，室溫條件下孵育4h；用所述PB緩沖液清洗后重懸于1mL所述PB緩沖液中，得到醛基化的磁珠溶液；

其中，所述PB緩沖液的濃度為50mM，pH 8.0；

A4、Fe₃O₄磁珠-AME單抗復合物溶液的制備：將100μL 2.7mg/mL的AME單克隆抗體加入到1mL A3制備的醛基化的磁珠溶液中，室溫條件下孵育過夜；加入200μL 50mg/mL的BSA溶液，室溫條件下孵育2h；經Tris-HCl緩沖液清洗后，重懸于10mL Tris-HCl緩沖液中，即得Fe₃O₄磁珠-AME單抗復合物溶液；

其中，Tris-HCl緩沖液的濃度為10mM，pH 8.0。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，B具體為：

B1、羧基化AME溶液的制備：將100mg AME溶于5mL DMF，加入75mg溴丁酸甲酯和150mg碳酸鉀，50℃攪拌反應2h，加入10mL水稀釋，然后用10mL乙酸乙酯進行萃取，有機相經濃縮后，得到100mg甲酯修飾的AME；取75mg甲酯修飾的AME和9mg氫氧化鋰溶解于由2.5mL的甲醇和2.5mL的四氫呋喃組成的混合液中，然后加入0.5mL水；將該混合溶液室溫下攪拌孵育5h；有機相經濃縮后，殘留物用2.5mL水進行稀釋；將該稀釋液的pH調至4.0，用5mL乙酸乙酯進行萃取，有機相經濃縮后得到羧基化AME溶液；

B2、CAT-AME復合物溶液的制備：將2mg EDC和1.6mg的NHS溶解于0.02mL 0.25mg/mL B1制備的羧基化AME溶液中，室溫條件下孵育5h，得到溶液I；然后將4mg CAT溶解于2mL Tris-HCl溶液中，得到CAT溶液；將所述CAT溶液逐滴加入上述溶液I中，室溫下攪拌12h；然后離心去除沉淀，上清液用Tris-HCl緩沖液透析72h，每12h更換一次透析液，即得CAT-AME復合物溶液；

其中，Tris-HCl溶液的濃度為10mM，pH 8.0；所述Tris-HCl緩沖液的濃度為10mM，pH8.0。