[發明專利]同時檢測中藥材污染三類產毒真菌的多重PCR引物、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201811592564.3
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109385488B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 徐暉;詹若挺;陳蔚文;羅朝權;王文麗;魯曉芳;鄭潤生
• 申請（專利權）人: 廣州中醫藥大學（廣州中醫藥研究院）
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 張玲春

本發明公開了一種同時檢測中藥材污染三類產毒真菌的多重PCR引物、方法及試劑盒。上述三類產毒真菌為黃曲霉毒素產生菌、雜色曲霉毒素產生菌和赭曲霉毒素產生菌?；诙嘀豍CR檢測方法，包括能在同一反應管中進行PCR反應的第一引物對、第二引物對、第三引物對和第四引物對。本發明建立了一種不經過分離純化，直接檢測中藥材污染產毒真菌的多重PCR體系，各引物特異性強，方法的檢出限為10²～10³CFU/g，檢測靈敏度高。

技術領域

本發明涉及同時檢測三類產毒真菌的多重PCR引物、方法及試劑盒，屬于生物技術檢測領域，特別涉及同時檢測中藥材污染三類產毒真菌的多重PCR引物、方法及試劑盒。

背景技術

中藥材受自身性質(含有大量淀粉、多糖等)的影響，在生產、加工、運輸、貯存過程中，很容易污染各種真菌而發生霉變，不但藥效價值降低，人誤服后會引起中毒。針對上述中藥材受真菌污染問題，我國已經制定了若干管理規范，但污染檢測方面仍然存在許多空白。例如《中國藥典》僅對強致癌物黃曲霉毒素規定了檢測方法和限量標準，《中國藥典》2015年版一部收錄了桃仁等十九味中藥中黃曲霉毒素的檢測方法，而對赭曲霉毒素、雜色曲霉毒素等其他多種真菌毒素沒有相應的限量要求，也缺乏相應的數據支持。雖然目前已經對真菌毒素出臺了相關限量標準，然而，真菌毒素的檢測方法只能在真菌產生真菌毒素的情況下才能發揮作用，無法在產毒真菌尚未產生真菌毒素時，主動采取相關防范措施。一旦所檢中藥材的真菌毒素含量超標，只能采取拋棄等被動處理方法，很容易造成資源浪費。因此，建立一種針對中藥材污染真菌的預警方法是非常必要的。

目前，在產毒真菌的種類檢測和鑒定方面已有深入的研究和廣泛的應用。傳統的產毒真菌鑒定方法一般是采用形態學鑒定法，根據真菌的形態、生理特點等特征加以區別。但是，該方法存在一定缺陷，如操作耗時長，需要較強的專業知識。隨著生物化學、遺傳學以及分子生物學的快速發展，人們對產毒真菌的遺傳信息認識日益深入，分子生物學的鑒定方法應用日益廣泛。利用生物可遺傳并可檢測的分子特征對生物的種類、品系等進行鑒定，稱為分子鑒定。產毒真菌分子鑒定的研究很多，相關的文獻綜述不少。目前，比較成熟的方法是多聚酶鏈式反應(PCR)技術、分子標記技術等。其中，PCR技術是建立中藥材污染真菌的檢測方法的有效手段。多重PCR檢測技術，是指在一個PCR反應體系中加入兩對或者兩對以上引物，能夠同時擴增出多個DNA片段，具有高效、快速、經濟等優點。國內外均有不少研究報道。

實現多重PCR檢測，引物的設計極為關鍵，直接影響著方法的特異性。例如：在赭曲霉毒素生物合成途徑基因PKS設計引物AoLC35 12L/AoLC35 12R和AoOTAL/AoOTAR，其中AoLC35-12L/AoLC35-12R引物僅僅對產赭曲霉毒素產生菌特異性，該二重PCR檢測方法成功鑒別赭曲霉毒素產生菌與不產毒菌株。Rodríguez等根據fluG該基因設計了特異性引物F-FluGc/R-FluGc，建立的多重實時熒光定量PCR，成功鑒別產雜色曲霉毒素菌株與不產毒菌株。秦文彥等根據黃曲霉毒素生物合成途徑中aflR、ver-1、omtA-1等基因上設計引物，成功建立了多重PCR檢測方法，并應用于食品及飼料表面中污染的黃曲霉菌和寄生曲霉菌的檢測。結果顯示，aflR、ver-1和omt-1基因上設計的引物能夠擴增出相應大小、清晰明亮的電泳條帶。而其余如青霉、煙曲霉、雜色曲霉和黑曲霉菌株的樣品只檢測出真菌保守區域共有的ITS片段。上述文獻報道均僅僅針對一類產毒真菌，例如黃曲霉毒素產生菌、赭曲霉毒素產生菌或者雜色曲霉毒素產生菌，而對于該三類產毒真菌之間的組合的檢測方法的相關報道甚少。目前，針對產毒真菌分子鑒定方法很多，但僅僅針對一類產毒真菌或者兩類產毒真菌，檢測范圍小，沒有系統性對中藥材受產毒真菌污染的情況進行詳細的分析。