[發明專利]同時檢測中藥材污染三類產毒真菌的多重PCR引物、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201811592564.3
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109385488B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 徐暉;詹若挺;陳蔚文;羅朝權;王文麗;魯曉芳;鄭潤生
• 申請（專利權）人: 廣州中醫藥大學（廣州中醫藥研究院）
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 張玲春

1.同時檢測中藥材污染三類產毒真菌的多重PCR方法，上述三類產毒真菌為黃曲霉毒素產生菌、雜色曲霉毒素產生菌和赭曲霉毒素產生菌，其特征在于，所述多重PCR方法包括以下步驟：

(1)提取、純化產毒菌DNA，采用改良的CTAB法，作為模板DNA；所述改良的CTAB法為CTAB法結合核酸純化柱；步驟(1)中，所述改良的CTAB法包括以下步驟：

收集藥材于EP管中，加入管體積3/5的0.1％吐溫20，劇烈振蕩，取混懸液濾過，收集濾液，離心，棄上清，取菌體加入裂解液，振蕩10～15min，恒溫水浴15～25min，放置2～3min，添加等量體積比為24:1的氯仿:異戊醇，振蕩，離心，取上清，加入2/3體積的異丙醇混勻，轉移至核酸DNA純化柱中，靜置3～5min，高速離心，加入70％乙醇洗滌，空柱子離心2～3min，收集洗脫液，-20℃保存；

(2)利用一組4對引物對、PCR體系對模板DNA進行多重PCR擴增；

所述一組4對引物對包括能在同一反應管中進行PCR反應的第一引物對、第二引物對、第三引物對和第四引物對，其中，

第一引物對用以擴增真菌rDNA基因Wen，包括正向引物Wen2F和反向引物Wen2R，分別包括SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02所示的序列；正向引物Wen2F為5’-TTCCATGCGAGCCCAACCTCCC-3’，反向引物Wen2R為5’-AGGGGACGACGACCCAAACA-3’，擴增產物大小為370bp；

第二引物對用以擴增黃曲霉毒素合成基因AF，包括正向引物AF-1F和反向引物AF-1R，分別包括SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04所示的序列；正向引物AF-1F為5’-GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC-3’，反向引物AF-1R為5’-GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG-3’，擴增產物大小為780bp；

第三引物對用以擴增黃曲霉毒素、雜色曲霉毒素共同的合成基因AFST，包括正向引物AFST-1F和反向引物AFST-1R，分別包括SEQ ID NO.05和SEQ ID NO.06所示的序列；正向引物AFST-1F為5’-GGCCCTTGTGGTGGGGTTCAAATCGGTGA-3’，反向引物AFST-1R為5’-CTTAGGTGACGACTTGGCGGGCTTTGATC-3’，擴增產物大小為1400bp；

第四引物對用以擴增赭曲霉毒素合成基因OTA，包括正向引物OTA-1F和反向引物OTA-1R，分別包括SEQ ID NO.07和SEQ ID NO.08所示的序列；正向引物OTA-1F為5’-GCCAGACCATCGACACTGCATGCTC-3’，反向引物OTA-1R為5’-CGACTGGCGTTCCAGTACCATGAGCC-3’，擴增產物大小為540bp；

步驟(2)中，在20μL PCR反應體系中，引物配比是AF-1:AFST-1:OTA-1:Wen2＝2:1:2:2；

(3)對擴增產物進行檢測；

從而對所述中藥材中三類產毒真菌的存在與否進行分析。

2.根據權利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于，

根據權利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于，步驟(2)中，所述PCR體系為：

所述多重PCR擴增的反應條件為：

3.根據權利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于：步驟(3)中，所述對擴增產物進行檢測為瓊脂糖凝膠電泳分離以及凝膠成像系統拍照觀察；其具體步驟為：配制1.5％瓊脂糖凝膠，將PCR擴增產物加入凝膠點樣孔中，進行電泳分離；電泳產物在凝膠成像系統中成像，確認有無目的條帶。