[發明專利]一種特異性鑒別和尚菱的RAPD-SCAR標記及其鑒別方法

在審

• 申請號: 201811591602.3
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109468317A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 張艷梅;杭悅宇;孫小芹;陳閩;薛佳宇
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

本發明公開了一種特異性鑒別和尚菱的RAPD?SCAR標記及其鑒別方法。一條能夠在和尚菱中擴增到的特異性DNA片段，該片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。根據此特異性片段的核苷酸序列，設計序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的一對引物，能夠在和尚菱中擴增出特定長度的片段，而在其它歐菱品種或細果野菱中則不能擴增出該片段，從而實現對和尚菱的特異性鑒別。本發明操作簡便、穩定可靠，是第一個應用于和尚菱品種的分子鑒定方法，可用于該品種的選種、育種、種植、采收和品種貿易等各環節中的快速鑒定，同時對保護蘇州市優良地方品種的種質資源具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于分子標記鑒定領域，特別涉及一種鑒定和尚菱的特異性分子標記及方法。

背景技術

菱（Trapa natans L.）為菱科（Trapaceae）菱屬（Trapa Linnaeus）一年生浮水草本，是重要的水生經濟植物，主要分布于歐亞及非洲熱帶、亞熱帶和溫帶地區，我國分布廣泛尤其是長江中下游地區。我國菱的栽培歷史悠久，太湖地區很可能是中國菱的馴化栽培起源中心。

由于菱屬植物形態性狀變異復雜，國內外學者對菱屬的種類劃分爭議較大。Vassiljev認為全世界有70余種，Kak認為約有30種，Cook認為全世界菱屬植物是一多形種或約20種，而Tutin等則將歐洲13種菱歸并成1種。《中國水生高等植物圖說》中記載菱屬30種，我國11種；《中國植物志》記載菱屬15種，而《Flora of China》認為菱屬只有歐菱（T.natans L.）和細果野菱（T. incisa Siebold & Zuccarini）兩種。

除形態研究外，運用數量分類學、細胞分類學、花粉形態學等方法對菱屬的種的劃分也有大量的報道。如數量分類研究，將湖北地區17個菱科植物分為5種8個變種；基于花粉和花、果形態，將浙江省9個菱屬植物歸屬野菱、烏菱和細果野菱3種；依果體大小，中國菱屬可劃分成3大類群，種間果喙和腰角變異式樣豐富，可以作為鑒別性狀；按照園藝學分類依據和標準，菱被分為四角菱、兩角菱和無角菱3類。由于菱屬植物在未結菱時植株形態的相似以及分類標準的不確定性，因此種類鑒別、品種鑒別有很大的局限性。

近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，研究人員開始依據DNA遺傳物質來研究菱屬植物親緣關系及物種鑒定。如篩選出鑒別歐菱和細果野菱的RAPD分子標記、核基因AP2和葉綠體基因trnL-F；確定ITS序列對部分菱屬種類具有鑒別意義等。但是之前的研究只是針對一類菱進行區分，而針對某一菱品種的特異性鑒別還未見報道。

和尚菱是蘇州吳縣地方品種，栽培歷史悠久，因果實半圓形，一側較平，一側鼓起，無角而稱之。和尚菱果殼較薄，水分多，質脆，味稍甜，口感佳，雖然其果實形態特殊，但是對于未結菱時的植株和果實去殼后的果肉無法與其它菱進行區分，給農業生產和商品產業造成很大的困難，因此開發其專一性、特異性鑒別的分子標記對于傳統農作物的品種保護具有重要的科學意義。

本發明是首次對蘇州地方品種—和尚菱進行分子標記的研究，本發明提供的鑒定蘇州和尚菱的RAPD-SCAR標記方法具有操作簡單、靈敏度高、重復性好等優點，能夠實現對該品種的特異性鑒定，對于保護優良地方品種的種質資源具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種鑒定蘇州吳縣地方品種—和尚菱的特異性分子標記方法，通過篩選到的RAPD引物在和尚菱中擴增出特異性條帶，并針對該特異性條帶設計SCAR引物，利用這對引物可通過簡單的DNA片段擴增技術將和尚菱和其它菱品種區分開來，實現對和尚菱的快速、準確鑒定。該發明為菱的品種鑒別和種植資源保護提供了有力的技術支持。

本發明通過33條RAPD引物對和尚菱和其它3種長江中下游地區常見栽培的歐菱（包括老烏菱、紅繡鞋和水紅菱）及1種野外采集的細果野菱進行PCR擴增，篩選出能夠在和尚菱中擴增出特異性條帶的RAPD引物，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示。