[發明專利]一種特異性鑒別和尚菱的RAPD-SCAR標記及其鑒別方法

在審

• 申請號: 201811591602.3
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109468317A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 張艷梅;杭悅宇;孫小芹;陳閩;薛佳宇
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

1. 能夠在和尚菱中擴增到的特異性DNA片段，其特征在于，該片段的核苷酸序列如SEQID NO: 2所示。

2. 針對權利要求1所述的特異性DNA片段設計的SCAR引物，其特征在于，該SCAR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示。

3.權利要求1所述的特異性DNA片段在鑒別歐菱品種和尚菱中的應用。

4.權利要求2所述的引物在鑒別歐菱品種和尚菱中的應用。

5.權利要求2所述的引物在制備鑒別和尚菱的試劑中的應用。

6.一種和尚菱的分子鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）采用RAPD引物對由菱品種構建的DNA個體混合池進行PCR擴增，篩選出一條能夠在和尚菱中擴增出特異性DNA片段的引物，該引物序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）將步驟（1）中的特異性片段進行切膠回收并測序，測得和尚菱中特異性片段的序列如SEQ ID NO: 2所示；

（3）針對特異性DNA片段SEQ ID NO: 2設計SCAR引物，SCAR引物序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；

（4）利用步驟（3）所述的引物，對待測菱品種的基因組DNA進行常規的PCR擴增；

（5）通過瓊脂糖凝膠電泳對步驟（4）擴增產物進行檢測，鑒定電泳結果中是否出現318bp特異性DNA片段的位置條帶，若出現該條帶，則表明待測菱品種為和尚菱；若不出現該條帶，則表明待測菱品種不是和尚菱。

7. 根據權利要求6所述的分子鑒別方法，其特征在于，所述步驟（4）中進行PCR擴增的反應體系為20 μL，其組分及終濃度為：DNA模板（20 ng/μL）1.0 μL，2×Reaction Mix（含20mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl₂，400 μM的dNTPs，溴酚藍）10.0 μL，引物（10 mM）各0.8 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/μL）0.4 μL，最后用雙蒸水補齊至20 μL；

擴增程序為：94℃，5 min預變性；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環；最后72℃延伸8 min。

8. 根據權利要求6所述的分子鑒別方法，其特征在于，所述步驟（5）中PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠EB染色，電壓100 V，電泳0.5 h后用凝膠成像系統觀察、拍照，用2000 bp的DNA marker作為分子量標記。