[發明專利]一種基于小麥種胚注射農桿菌的小麥遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201811590260.3
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109652438A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 劉文軒;董振杰;余濟辰;劉紫林;馬超;李歡歡;田修斌;朱昌濤;王剛;石珊珊
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

本發明公開了一種基于小麥種胚注射農桿菌的小麥遺傳轉化方法，涉及遺傳轉化技術領域，所述小麥遺傳轉化方法包括以下步驟：1)受體準備；2)菌懸液制備；3)種胚注射農桿菌轉化。為了解決傳統的小麥遺傳轉化技術因需要離體組織培養與再生的過程而導致成本高、周期長且再生率低的問題，本發明通過在種胚內直接注入攜帶目標基因農桿菌的方法將目標基因導入小麥活體，結合目標基因PCR檢測技術得到了可遺傳的轉基因后代，不需要基因槍等貴重儀器設備，成本低廉，一般實驗室均可操作，且具有良好的再生率，無組織培養與再生過程，周期較短，且無小麥基因型依賴問題，同時取材方便，一年四季可以操作。

技術領域

本發明涉及遺傳轉化技術領域，具體是一種基于小麥種胚注射農桿菌的小麥遺傳轉化方法。

背景技術

小麥是世界上重要的糧食作物之一，是禾本科小麥屬的重要栽培谷物。為了提高小麥的產量，通常需要采用小麥遺傳轉化技術將外源目的基因按照需要在體外采用人工重組導入小麥，進而補充和改進傳統的雜交育種，大大縮短了育種周期。其中，小麥遺傳轉化技術，即將目標基因導入小麥體內，并穩定遺傳和表達目標性狀的技術，是小麥轉基因育種，基因編輯育種，基因克隆與功能研究的基礎。

目前，小麥遺傳轉化技術主要有基因槍轉化和農桿菌介導的遺傳轉化法兩大類，這兩類轉化方法都需要離體組織培養與再生的過程，導致這一過程的成本高、周期長且再生率低。因此，設計一種簡便有效低成本的基于小麥種胚注射農桿菌的小麥遺傳轉化方法，成為目前亟需解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于小麥種胚注射農桿菌的小麥遺傳轉化方法，以解決上述背景技術中提出的問題，通過直接以成熟種子胚為轉化對象，通過在種胚內直接注入攜帶目標基因農桿菌來將目標基因導入小麥活體，結合目標基因PCR檢測技術，得到了可遺傳的轉基因后代。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種基于小麥種胚注射農桿菌的小麥遺傳轉化方法，其特征在于，它包括以下步驟：

1)受體準備：選取受體的健康種子用蒸餾水進行沖洗3-5次，然后用質量濃度為1.5％的次氯酸鈉進行浸泡消毒15min，再采用蒸餾水浸泡10min，然后用蒸餾水沖洗種子至無消毒液氣味后置于鋪兩層濾紙的培養皿中，再加水至剛剛沒過種子并在25℃下萌動發芽，得發芽種子A，備用；

2)菌懸液制備：將根癌農桿菌進行增殖培養得到菌液，然后倒入50ml的EP管中并在4℃下以4000rpm的速率進行離心10min，再除去上清液并加入10ml左右新鮮無抗生素的YEB培養液，調節OD值至0.9-1.2，然后加入乙酰丁香酮至終濃度為200μM，再在室溫培養12小時進行活化，得農桿菌菌液B，備用；

3)種胚注射農桿菌轉化：挑取步驟1)中的胚芽鞘長度達到0.5-1.0cm時(種子發芽時間為42-48小時)的發芽種子A，放至超凈工作臺風口處風干1小時，然后用1ml醫用皮試針吸取0.5ml的步驟2)中得到的農桿菌菌液B對發芽種子A進行注射菌液，再將注射過菌液的發芽種子A進行風干30分鐘，然后移載至盛有蛭石和草炭的營養缽中，澆透水后在室溫下繼續培育，即可。

作為本發明進一步的方案：步驟1)中，所述受體為普通小麥品種Bobwhite(國外轉基因常用受體品種)和偃展4110(國內大面積種植品種)。

作為本發明再進一步的方案：步驟2)中，所述根癌農桿菌為將β-葡萄糖苷酸酶(GUS)編碼基因連接在質粒載體pWMB110上得到的含有pWMB110質粒的根癌農桿菌。

作為本發明再進一步的方案：步驟2)中，所述增殖培養為吸取含有pWMB110質粒的根癌農桿菌加入至50ml的YEB液體培養基中，然后在28℃以200rpm的速率進行搖菌12小時，即可。