[發(fā)明專利]一種基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811590260.3
• 申請(qǐng)日: 2018-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN109652438A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉文軒;董振杰;余濟(jì)辰;劉紫林;馬超;李歡歡;田修斌;朱昌濤;王剛;石珊珊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，它包括以下步驟：

1)受體準(zhǔn)備：選取受體的健康種子用蒸餾水進(jìn)行沖洗，然后用質(zhì)量濃度為1.5％的次氯酸鈉進(jìn)行浸泡消毒15min，再采用蒸餾水浸泡10min，然后用蒸餾水沖洗種子至無(wú)消毒液氣味后置于鋪兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，再加水沒過種子并在25℃下萌動(dòng)發(fā)芽，得發(fā)芽種子A，備用；

2)菌懸液制備：將根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)得到菌液，然后在4℃下以4000rpm的速率進(jìn)行離心10min，再除去上清液并加入YEB培養(yǎng)液，然后加入乙酰丁香酮至終濃度為200μM，再在室溫培養(yǎng)12小時(shí)進(jìn)行活化，得農(nóng)桿菌菌液B，備用；

3)種胚注射農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：挑取步驟1)中的發(fā)芽種子A放至超凈工作臺(tái)風(fēng)口處風(fēng)干1小時(shí)，然后吸取0.5ml的步驟2)中得到的農(nóng)桿菌菌液B對(duì)發(fā)芽種子A進(jìn)行注射菌液，再將注射過菌液的發(fā)芽種子A進(jìn)行風(fēng)干30分鐘，然后移載至盛有蛭石和草炭的營(yíng)養(yǎng)缽中，澆透水后在室溫下繼續(xù)培育，即可。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟1)中，所述受體為小麥品種Bobwhite和偃展4110。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2)中，所述根癌農(nóng)桿菌為將β-葡萄糖苷酸酶編碼基因連接在質(zhì)粒載體pWMB110上得到的含有pWMB110質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟2)中，所述增殖培養(yǎng)為吸取含有pWMB110質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌加入至50ml的YEB液體培養(yǎng)基中，然后在28℃以200rpm的速率進(jìn)行搖菌12小時(shí)，即可。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述YEB液體培養(yǎng)基包括50μl的濃度為50mg/ml的卡那霉素和50μl的濃度為50mg/ml的利福平。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟3)中，所述注射菌液為將發(fā)芽種子A的胚芽鞘和種胚向上，一手用鑷子固定發(fā)芽種子A，另一手沿發(fā)芽種子A的胚芽鞘向種胚內(nèi)注射菌液，直至有菌液從胚芽鞘端部滲出。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟3)中，所述蛭石和草炭的重量比為2:1。

8.一種如權(quán)利要求1-7任一所述的基于小麥種胚注射農(nóng)桿菌的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法在小麥轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。