[發明專利]抗體人源化改造方法

在審

• 申請號: 201811587711.8
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109628531A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 高晨陽;陸曉峰;雷鳴;王卓智;李競;陳智勝
• 申請（專利權）人: 上海藥明生物技術有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權

本發明公開一種抗體人源化改造方法，使用N?糖苷酶處理抗體人源化改造過程中的經純化后的IgG抗體蛋白；所述N?糖苷酶為PNGaseF酶，所述PNGaseF酶特異性識別蛋白中的序列Asn?X?Ser/Thr，完全去除糖基化的同時保留抗體蛋白中的二硫鍵；X代表除了脯氨酸外任意一種氨基酸。本發明還提供上述方法的具體應用。本發明的方法能夠有效的對現有技術中部分抗體在抗體人源化改造后期時仍存在的無法替換的氨基酸進行替換。通過上述方法，可以盡可能多的保留經過篩選且合適的人源序列、降低免疫反應的目的，同時又能夠最大限度的保留其特異性和親和力，從而達到合理的人源化的效果。

技術領域

本發明屬于分子生物學中抗體人源化設計研究領域，尤其是涉及到利用N-糖苷酶來去除可能影響到抗體互補決定區構象的N-糖基，以維持抗體分子的單一度和純凈度。

背景技術

目前，抗體人源化設計作為一種新的研發趨勢，已經成為了當今治療性抗體研發的過程中的重要環節。

抗體人源化：是一個復雜的過程，主要通過分子生物學實驗手段，輔以計算機對抗體蛋白質結構的預測和模擬，使鼠源單克隆抗體序列改造為與人源抗體序列盡可能相近的一種分子生物學操作方法。通過這種方法改造成功后的抗體，既保留了原本鼠源抗體的親和力和特異性，又降低了對人體造成的免疫副反應。但是在這個過程中，由于單克隆抗體蛋白分子結構的不完全確定性，或由于其分子結構本身的缺陷(如天然存在的糖基化的位點，空間結構中不合適的半胱氨酸的分布，還有一些容易導致脫酰胺作用出現的位點)，導致了不是所有的抗體蛋白都能被順利的人源化。

人源化抗體：是經由抗體人源化處理后的一種產物，一般包括嵌合抗體，改型抗體，表面重塑抗體和全人源化抗體等。處理后的抗體由于其大部分氨基酸序列被人源序列取代，所以對人體造成的免疫副反應有一定程度的降低。

糖基化：是蛋白質翻譯后修飾中最主要的修飾方式之一，在蛋白質的翻譯調控和降解中起到非常重要的作用。在已有的商業化抗體藥物中和在研的抗體藥物中均發現帶有糖基化。根據蛋白質和對應糖鏈的連接方式，可大致分為N-連接，O-連接，C-甘露糖這三種基本糖基化形式，再外加糖基磷脂酰肌醇錨定連接這種特殊形式。其中與本發明密切相關的是抗體蛋白結構中有較高概率存在的N-連接糖基化。

N-連接糖基化：是一種新生肽鏈的糖基化修飾形式。糖通過與肽鏈中的天冬酰胺的自由NH₂基團連接，主要的表現形式為Asn-X-Ser/Thr(X代表除了脯氨酸外任意一種氨基酸)結構的Asn酰胺基氨基與寡糖鏈(GlcNAC的β-羥基)N-連接糖蛋白。因此，將這種糖基化稱為N-連接的糖基化。根據他們的外層鏈結構的不同，可分為：高甘露糖型，雜合型，復合型三種。它們的區別是，高甘露糖型只含有多個α-連接的甘露糖殘基，復雜型含有以巖藻糖，半乳糖和唾液糖為組分的糖鏈殘基，雜合型則同時具有以上兩種特點。

就現有技術而言，在抗體人源化改造過程中，部分抗體的關鍵區域仍存在無法替換的氨基酸，無法完成最后的人源化步驟。現有技術難以有效解決這一問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于，提供一種抗體人源化改造方法，能有效的對現有技術中部分抗體在抗體人源化改造后期時仍存在的無法替換的氨基酸進行替換。通過上述方法，可以盡可能多的保留經過篩選且合適的人源序列、降低免疫反應的目的，同時又能夠最大限度的保留其特異性和親和力，從而達到合理的人源化的效果。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種抗體人源化改造方法，使用N-糖苷酶處理抗體人源化改造過程中的經純化后的IgG抗體蛋白；所述N-糖苷酶為PNGaseF酶，所述PNGaseF酶特異性識別蛋白中的序列Asn-X-Ser/Thr，完全去除糖基化的同時保留抗體蛋白中的二硫鍵；X代表除了脯氨酸外任意一種氨基酸。