[發(fā)明專(zhuān)利]薄殼山核桃MSAP技術(shù)體系的建立方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811586720.5
• 申請(qǐng)日: 2018-12-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109486918A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭方仁;劉壯壯;梁有旺;譚鵬鵬;曹凡
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6858
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6858
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李青

本發(fā)明提供了一種薄殼山核桃MSAP技術(shù)體系的建立方法，涉及分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明薄殼山核桃MSAP技術(shù)體系的建立方法，首先將薄殼山核桃基因組DNA雙酶切得到酶切產(chǎn)物，將得到的酶切產(chǎn)物與接頭引物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物；隨后將連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增得到預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，并將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行選擇擴(kuò)增；最后對(duì)選擇擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳及銀染顯色。通過(guò)上述方法建立一套客觀、科學(xué)、準(zhǔn)確的薄殼山核桃DNA甲基化分析技術(shù)體系，可以獲得銀染背景低、目的條帶清晰的DNA甲基化圖譜，具有可在未知基因組序列的情況下對(duì)全基因組甲基化開(kāi)展研究且甲基化位點(diǎn)易于檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種薄殼山核桃MSAP技術(shù)體系的建立方法。

背景技術(shù)

薄殼山核桃(Carya illinoensis Koch)，又名美國(guó)山核桃或長(zhǎng)山核桃，俗稱(chēng)“碧根果”，是胡桃科山核桃屬植物，原產(chǎn)美國(guó)和墨西哥北部，是世界上著名的干果樹(shù)種之一。薄殼山核桃其堅(jiān)果個(gè)大、殼薄，出仁率高，取仁容易，產(chǎn)量高，同時(shí)果仁色美味香、無(wú)澀味、營(yíng)養(yǎng)豐富，是理想的保健食品或面包、糖果等食品的添加材料。此外，薄殼山核桃亦是重要的木本油料植物，種仁油脂含量高在70％以上，其中不飽和脂肪酸含量高達(dá)97％，有很好的貯藏性，是上等的烹調(diào)用油和色拉油。薄殼山核桃在我國(guó)引種栽培已具有100多年的歷史，由于長(zhǎng)期存在的不科學(xué)的育種及種植方法，我國(guó)薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)存在優(yōu)良品種缺乏、擴(kuò)繁技術(shù)落后、配套管理技術(shù)不完善等問(wèn)題。因此，對(duì)薄殼山核桃的研究越來(lái)越得到國(guó)家和農(nóng)林科技人員的重視。

目前在薄殼山核桃遺傳育種改良方面已經(jīng)開(kāi)展了同屬不同種間的雜交育種、選擇育種和分子標(biāo)記輔助育種等工作，其中將傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)同不斷發(fā)展的生物技術(shù)結(jié)合來(lái)獲得優(yōu)良性狀是遺傳改良的工作重點(diǎn)。目前雖然已在薄殼山核桃遺傳育種改良方面開(kāi)展了相關(guān)工作，但是從DNA甲基化這一表觀遺傳調(diào)控層面出發(fā)并應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾途徑之一，能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，進(jìn)而影響基因表達(dá)，是大多數(shù)生物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可缺少的一部分。甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensitiveamplification polymorphism，MSAP)技術(shù)是一種對(duì)基因組DNA甲基化進(jìn)行分析的相對(duì)簡(jiǎn)單且較常用的方法。根據(jù)Hpa II及Msp I這兩種酶對(duì)基因組中“5’-CCGG-3’”位點(diǎn)中胞嘧啶甲基化狀態(tài)不同而具有不同的酶切活性，可以酶切產(chǎn)生多態(tài)性的DNA片段并最終通過(guò)比較PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜來(lái)分析DNA甲基化狀況。

因此，建立一套科學(xué)準(zhǔn)確的薄殼山核桃DNA甲基化分析技術(shù)體系，進(jìn)而在未知基因組序列的情況下對(duì)薄殼山核桃全基因組甲基化開(kāi)展研究，變得十分必要和迫切。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種薄殼山核桃MSAP技術(shù)體系的建立方法，所述薄殼山核桃MSAP技術(shù)體系建立后可以在未知基因組序列的情況下對(duì)薄殼山核桃全基因組甲基化開(kāi)展研究，通過(guò)遺傳學(xué)分子標(biāo)記的方法，對(duì)研究、培育抗病抗逆性強(qiáng)的新薄殼山核桃品種具有非常現(xiàn)實(shí)的意義。

本發(fā)明提供的一種薄殼山核桃MSAP技術(shù)體系的建立方法，所述方法包括以下步驟：

首先將薄殼山核桃基因組DNA雙酶切得到酶切產(chǎn)物，將得到的酶切產(chǎn)物與接頭引物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物；隨后將連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增得到預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，并將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行選擇擴(kuò)增；最后對(duì)選擇擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳及銀染顯色。

進(jìn)一步的，所述將薄殼山核桃基因組DNA雙酶切的酶切體系為：400ng DNA、0.3μLEcoR I-HF、0.3μL Msp I或0.3μL HpaⅡ、2μL Cut sm art Buffer、無(wú)菌水補(bǔ)足至20μL。

更進(jìn)一步的，所述酶切分為4～6個(gè)時(shí)間梯度，每一時(shí)間梯度酶切結(jié)束后放入65～70℃溫浴20min；