[發明專利]薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法

在審

• 申請號: 201811586720.5
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109486918A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 彭方仁;劉壯壯;梁有旺;譚鵬鵬;曹凡
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李青

1.一種薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

首先將薄殼山核桃基因組DNA進行雙酶切，將得到的酶切產物與接頭引物進行連接，得到連接產物；隨后將連接產物進行預擴增得到預擴增產物，并將預擴增產物進行選擇擴增；最后對選擇擴增的產物進行凝膠電泳及銀染顯色。

2.根據權利要求1所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，所述將薄殼山核桃基因組DNA雙酶切的酶切體系為：400ng DNA、0.3μL EcoR I-HF、0.3μL Msp I或0.3μL HpaⅡ、2μL Cut smart Buffer、無菌水補足至20μL。

3.根據權利要求2所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，所述酶切分為4～6個時間梯度，每一時間梯度酶切結束后放入65～70℃溫浴20min；

優選的，所述酶切的溫度為35～37℃，所述酶切的時間為5h。

4.根據權利要求1所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，所述酶切產物與接頭引物進行連接的反應體系為：酶切產物20μL、0.1μl T4 DNA ligase、2.5μlATP、E adaptor和H/M adaptor均為0.5μL，無菌水補足至25μL；

優選的，所述E-adaptor接頭引物，其上游引物為：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，下游引物為：5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’；

所述H/M adaptor接頭引物，其上游引物為：5’-GACGATGAGTCTAGAA-3’，下游引物為：5’-CGTTCTAGACTCATC-3’。

5.根據權利要求1所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，所述預擴增反應體系為：0.5～2.5μl連接產物、0.1～0.3μl Ex Taq酶、1～3μl dNTP、預擴增引物pre-E和pre-H/M各0.5～2.5μL，2.5μl 10×Ex Taq Buffer，無菌水補足至25μl。

6.根據權利要求5所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，其中：

所述預擴增引物pre-E為：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’，

預擴增引物pre-H/M為：5’-GATGAGTCTAGAACGGT-3’。

7.根據權利要求1所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，所述選擇擴增反應體系為：稀釋0～200倍的預擴增產物0.5～2.5μl、Ex Taq酶0.1～0.3μl、0.5～2.5μl dNTP、選擇擴增引物En0.3～2μl、選擇擴增引物HMn0.3～2μl、2.5μl 10×Ex TaqBuffer，無菌水補足至25μl。

8.根據權利要求7所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，其中：

所述選擇擴增引物En序列為：5’-GACTGCGTACCAATTCAXX-3’，

所述選擇擴增引物HMn序列為：5’-GATGAGTCTAGAACGGTXX-3’，

所述引物序列中X代表A，T，C，G四種堿基中的任意一種。

9.根據權利要求1所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，所述方法還包括對引物進行篩選的步驟。

10.根據權利要求1～9任一項所述的薄殼山核桃MSAP技術體系的建立方法，其特征在于，所述薄殼山核桃的品種為‘波尼’和‘紹興’。