[發(fā)明專利]一種從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811586319.1
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109609539B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發(fā)明（設計）人: 陶玲;李光飛;李蓉
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學院
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/16;C12P21/02;C07K14/575;C07K1/18;C12R1/84
• 代理公司: 西安銘澤知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 李振瑞

1.一種從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，合成一段編碼ELABELA多肽的SEQ ID NO. 1所示DNA序列，并將這段DNA序列克隆到畢赤酵母表達載體pGAPHαA上，得到重組表達載體pGAPHαA-ELABELA；然后將構建好的重組表達載體pGAPHαA-ELABELA通過轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，構建出能夠表達ELABELA多肽的重組畢赤酵母；利用重組畢赤酵母表達外源的ELABELA多肽，并將其分泌到酵母培養(yǎng)液上清中，將酵母培養(yǎng)液上清中的ELABELA多肽提取純化，得到ELABELA多肽；所述畢赤酵母表達載體pGAPHαA是在商業(yè)化載體pGAPZαA基礎上改進得到的，采用潮霉素抗性基因替代了原始pGAPZαA上的zeocin抗性基因。

2.根據(jù)權利要求1所述的從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，重組表達載體pGAPHαA-ELABELA按照以下步驟構建：合成PCR引物ELAF和ELAR，ELAF:5′-GAAAAG AGA GGC TGA AGC T-3′; ELAR:5′-GTC TAA GGC TAA AAC TCA-3′；以SEQ ID NO. 1所示DNA序列為模板，擴增獲得elabela基因PCR擴增產(chǎn)物；合成PCR引物PVF和PVR，PVF:5′-TGAGTT TTA GCC TTA GAC-3′，PVR:5′-TCT CAT CGT TTC GAA TA-3′；以畢赤酵母表達載體pGAPHαA為模板，擴增獲得pGAPHαA載體PCR產(chǎn)物；elabela基因PCR擴增產(chǎn)物和pGAPHαA載體PCR產(chǎn)物進行重組連接，得到重組表達載體pGAPHαA-ELABELA。

3.根據(jù)權利要求1所述的從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，能夠表達ELABELA多肽的重組畢赤酵母按照以下步驟構建：合成PCR引物Line GAP1和LineGAP2，Line GAP1: 5′-GTTGCGGGTAAA ACGGAG-3′；Line GAP2: 5′-ATGCTGGGAAGAGCAT-3′，設置PCR程序，以重組表達載體pGAPHαA-ELABELA為模板，擴增獲得線性化的pGAPHαA-ELABELA；

將線性化pGAPHαA-ELABELA 電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母細胞懸液中，得到轉(zhuǎn)化有pGAPHαA-ELABELA DNA的重組畢赤酵母細胞。

4.根據(jù)權利要求3所述的從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，所述畢赤酵母細胞為畢赤酵母X33。

5.根據(jù)權利要求1所述的從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，利用重組畢赤酵母表達外源的ELABELA多肽，并將其分泌到酵母培養(yǎng)液上清中的步驟如下：將轉(zhuǎn)化了重組表達載體pGAPHαA-ELABELA的畢赤酵母細胞接種于液體YPDH培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩搖床上30℃、200rpm培養(yǎng)24 ~ 72小時；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到離心管中，離心以獲取上清，上清中即有重組畢赤酵母細胞分泌表達的ELABELA多肽；液體YPDH培養(yǎng)基成分如下：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，潮霉素B 200mg，蒸餾水定容至1L。

6.根據(jù)權利要求5所述的從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，離心的條件為：1500g離心力4℃離心5分鐘。

7.根據(jù)權利要求5所述的從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，利用陽離子交換層析方式、陰離子交換層析方式，或者陰/陽組合的離子交換層析方式，在pH9.0 ~ 10.0之間對ELABELA多肽進行純化。

8.根據(jù)權利要求7所述的從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，純化時采用的層析介質(zhì)為陽離子交換層析介質(zhì)Capto S或者Nuvia^TM S，或者陰離子交換層析介質(zhì)Q sepharose high performance。

9.根據(jù)權利要求7所述的從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，其特征在于，陽離子交換層析方式如下：將含有ELABELA多肽的重組畢赤酵母培養(yǎng)液上清調(diào)節(jié)pH至pH 9.0~ 10.0，得到堿性畢赤酵母培養(yǎng)液上清；陽離子交換層析柱平衡；將堿性畢赤酵母培養(yǎng)液上清上樣于平衡好的陽離子交換層析柱中；上樣完畢后，使用10 ~ 50mM、pH 9.0 ~ 10.0甘氨酸-氫氧化鈉溶液沖洗陽離子交換層析柱，充分洗去陽離子交換層析柱上未結合的培養(yǎng)液上清成分；沖洗完畢后，使用洗脫液對層析柱上結合的蛋白質(zhì)進行洗脫，得到ELABELA陽離子交換層析洗脫液，即純化的ELABELA多肽溶液；所述洗脫液的要求如下：pH 9.0 ~ 10.0的甘氨酸溶液中加入氯化鈉，并使氯化鈉的終濃度為0.3 ~1.0M；同一次純化步驟中甘氨酸-氫氧化鈉溶液、洗脫液采用相同的pH。