[發明專利]一種從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法

有效

• 申請號: 201811586319.1
• 申請日: 2018-12-25
• 公開（公告）號: CN109609539B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 陶玲;李光飛;李蓉
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/16;C12P21/02;C07K14/575;C07K1/18;C12R1/84
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 李振瑞

本發明屬于多肽制備方法技術領域，具體涉及一種從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法。合成編碼ELABELA多肽的SEQ ID NO.1所示DNA序列，并將這段DNA序列克隆到畢赤酵母表達載體pGAPHαA上，得到重組表達載體pGAPHαA?ELABELA；然后將重組表達載體pGAPHαA?ELABELA整合到畢赤酵母染色體中，構建出能夠表達ELABELA多肽的重組畢赤酵母；利用重組畢赤酵母表達外源的ELABELA多肽，提取并純化ELABELA多肽，得到ELABELA多肽。本發明在生物體內制備的純天然狀態多肽，無需化學合成法中采用的二甲基甲酰胺和二氯甲烷等多種有毒有害試劑。

技術領域

本發明屬于多肽制備技術領域，具體涉及一種從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法。

背景技術

利用重組細胞表達外源基因是分子生物學研究和生物醫藥開發中常用的技術。被用來作為表達宿主的細胞包括細菌、真菌(酵母和絲狀真菌)、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。其中酵母是最簡單的真核生物細胞，其作為表達宿主具有一系列優點，被用作重組乙肝疫苗或重組人血漿白蛋白等一系列蛋白質的生產。

目前常用來進行基因工程構建的酵母，包括釀酒酵母和畢赤酵母。其中畢赤酵母被廣泛用來表達外源蛋白。一系列表達載體被用于構建基因重組的畢赤酵母，包括pPIC9K、pGAPZαA等。

Elabela是一種新近發現的由32個氨基酸組成的人體多肽激素，與apelin13受體相結合，由孕期胚胎滋養細胞表達，研究表明ELABELA多肽與胚胎心血管發育密切相關，Elabela的缺乏與孕婦先兆子癇病癥之間存在密切關系。目前Elabela的制備方法主要是化學合成法?；瘜W合成法采用多種有毒有害試劑，如二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷，對操作者和環境均不友好，操作過程需要佩戴防護面具，保持通風，同時廢棄物需要做無害化處理。因此需要開發一種不使用二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷等多種有毒有害試劑的生物法。

發明內容

本發明提供了一種從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，是在生物體內制備的純天然狀態多肽，無需化學合成法中采用的二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷等多種有毒有害試劑。

本發明的第一個目的是提供一種從重組畢赤酵母中制備ELABELA多肽的方法，合成一段編碼ELABELA多肽的SEQ ID NO.1所示DNA序列，并將這段DNA序列克隆到畢赤酵母表達載體pGAPHαA上，得到重組表達載體pGAPHαA-ELABELA；然后將構建好的重組表達載體pGAPHαA-ELABELA轉化到畢赤酵母染色體中，構建出能夠表達ELABELA多肽的重組畢赤酵母；利用重組畢赤酵母表達外源的ELABELA多肽，并將其分泌到酵母培養液上清中，將酵母培養液上清中的ELABELA多肽提取純化，得到ELABELA多肽。

優選的，重組表達載體pGAPHαA-ELABELA按照以下步驟構建：

合成PCR引物ELAF和ELAR，ELAF:5′-GAA AAG AGA GGC TGA AGC T-3′；ELAR:5′-GTC TAA GGC TAA AAC TCA-3′；以SEQ ID NO.1所示DNA序列為模板，擴增獲得elabela基因PCR擴增產物；

合成PCR引物PVF和PVR，PVF:5′-TGA GTT TTA GCC TTA GAC-3′，PVR:5′-TCT CATCGT TTC GAA TA-3′；以畢赤酵母表達載體pGAPHαA為模板，擴增獲得pGAPHαA載體PCR產物；

elabela基因PCR擴增產物和pGAPHαA載體PCR產物進行重組連接，得到重組表達載體pGAPHαA-ELABELA。

優選的，所述畢赤酵母表達載體pGAPHαA是在商業化載體pGAPZαA基礎上改進得到的，采用潮霉素抗性基因替代了原始pGAPZαA上的zeocin抗性基因。