[發明專利]基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法

有效

• 申請號: 201811585965.6
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109680074B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 麻柱;郭勇;王彥平;王相國;劉林;李艷華;呂小青
• 申請（專利權）人: 北京奶牛中心;北京農學院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 北京匯智英財專利代理事務所(普通合伙) 11301
• 代理人: 王志明

1.一種基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S1：于奶牛人工受精后的20天內，每天定期提取人工輸精后的奶牛的血液，或者，僅提取受精后第10天、第13天、第16天及第19天的血液；步驟S2：從上述血液中提取DNA；

步驟S3：設計αv基因引物和β3基因引物；

步驟S4：利用步驟S3所設計的引物，對步驟S2中提取到的DNA進行PCR擴增；

步驟S5：對擴增后的DNA進行αv基因和β3基因的相對表達量的測定以及αv基因和β3基因蛋白質的表達水平的測定，根據測定結果判斷奶牛是否成功受孕；其中，所述受孕為奶牛第二胎受孕；

所述步驟S5的判斷原則包括：

若第13天的奶牛血液對應的擴增后的DNA相比第10天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其αv基因相對表達量提升了一倍以上，則奶牛成功受孕，若αv基因相對表達量變化不大，則奶牛未成功受孕；

所述步驟S3中，所設計的αv基因引物包括：αv基因上游引物αv-F：caagagcagcgaggactttg，以及αv基因下游引物αv-R：gccgataaacacatatgcgt；所設計的β3基因引物包括：β3基因上游引物β3-F：tggggctgatgactgagagaag，以及β3基因下游引物β3-R：acgcacttccagctctat。

2.如權利要求1所述的基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法，其特征在于，所述步驟S5中的判斷原則還包括：

若第16天的奶牛血液對應的擴增后的DNA相比第13天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其αv基因相對表達量無明顯變化，則奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液對應的擴增后的DNA相比第13天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其第16天的αv基因相對表達量占第13天的相對表達量值的5%以下，則奶牛未成功受孕；

若第16天的奶牛血液對應的擴增后的DNA相比第13天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其β3基因相對表達量提升了一倍以上，則奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液對應的擴增后的DNA相比第13天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其第16天的β3基因相對表達量占第13天的相對表達量的5%以下，則奶牛未成功受孕；

若第16天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白質表達水平，相比第10天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白質表達水平，提升了一倍以上，則奶牛成功受孕；若第16天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白質表達水平，相比第10天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其第16天的αv基因或β3基因的蛋白質表達水平占第10天的表達水平值5%以下，則奶牛未成功受孕。

3.如權利要求1所述的基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法，其特征在于：所述步驟S2中，提取的DNA的方法包括：

步驟S21，勻漿處理：取1mL凍存牛全血，加入3mL紅細胞裂解液混合，室溫靜置10分鐘，10000rpm離心1分鐘，吸棄上清，收集紅細胞沉淀；

步驟S22，分層：向收集的紅細胞沉淀中加入500uL Trizol溶液，室溫靜置5分鐘使紅細胞沉淀充分溶解，再加入200uL氯仿搖勻后室溫靜置3分鐘；

步驟S23，沉淀RNA：將步驟S22最后所得樣品12000rpm下離心10分鐘后，獲得分三層樣品，轉移最上層的水相并向轉移后的最上層的水相中加入400uL冰乙醇，室溫靜置10分鐘，之后4攝氏度下12000rpm離心10分鐘，取管底沉淀物即RNA；

步驟S24，漂洗RNA沉淀：向步驟S23所得RNA沉淀物中加入75%的乙醇溶液，震蕩懸浮，后4攝氏度下6000rpm離心1分鐘，吸棄上清，將沉淀室溫晾干；

步驟S25：向步驟S24得到的RNA沉淀中加入50uL 無酶無菌水溶液溶解RNA沉淀；

步驟S26：溶解后的RNA進行反轉錄合成DNA。