[發明專利]基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法

有效

• 申請號: 201811585965.6
• 申請日: 2018-12-24
• 公開（公告）號: CN109680074B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 麻柱;郭勇;王彥平;王相國;劉林;李艷華;呂小青
• 申請（專利權）人: 北京奶牛中心;北京農學院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 北京匯智英財專利代理事務所(普通合伙) 11301
• 代理人: 王志明

本發明涉及基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法，通過研究奶牛在受孕前后的整合素αvβ3表達變化規律，探究其與奶牛早期妊娠的關系，篩選影響早期妊娠的因子，從而研發奶牛早期孕檢的檢測試劑盒。本發明提供的基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法，將奶牛的妊娠檢測窗口提前到輸精后的第16天，比目前常用方法提前了12天，可有效降低奶牛養殖業的繁殖成本，提高奶牛行業中母牛的利用效率，增加經濟收入。

技術領域

本發明涉及分子生物學及遺傳育種技術領域，具體涉及一種基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法。

背景技術

配種效率的高低對牧場的奶牛生產有著直接影響，輸精后一段時間后對奶牛進行早期妊娠診斷，如果存在相關技術那么這段時間越早就越可以提前區分奶牛是否妊娠，從而可以提前對妊娠奶牛進行必要的保胎措施，并對未受孕的奶牛采取二次輸精，將屢配不孕奶牛淘汰。目前孕期奶牛的成本主要包括飼料和人工，按照每頭牛每天25元，每提前一天檢測出一頭奶牛受孕失敗則養殖場將避免不必要支出25元，進而提高奶牛養殖場的經濟收入。

眾多妊娠檢測中常見的有直腸觸診法、超聲波檢查法等臨床診斷法和孕酮、早期妊娠因子等免疫診斷方法。以上檢測方法在檢測對象、檢測成本、操作難度和對檢測對象的傷害等方面表現各不相同，但就檢測窗口的時間而言最早在輸精后第28天。牛胚胎著床過程中子宮容受態建立發生在輸精后第10到第20天，整合素αvβ3有可能在這段時間發生mRNA水平表達量的變化。如果將受孕率與整合素αvβ3在mRNA水平表達量建立聯系，這一聯系有可能成為把奶牛早期妊娠的檢測窗口提前到第10-18天的理論基礎。

整合素αvβ3是一種異二聚體的跨膜糖蛋白，主要功能是結合配體介導細胞之間、細胞與胞外間質之間的相互作用，研究發現其在奶牛早期妊娠中有重要作用。在胚胎著床過程相關研究證明整合素αvβ3參與了子宮內膜容受態的建立。目前在人的臨床中提出整合素αvβ3與其配體的檢測對子宮的容受態和非容受態進行鑒別。子宮容受態的建立與否是妊娠成功的重要影響因素，妊娠失敗多發生在該階段。因此在該階段進行妊娠成功的檢測十分有意義，可檢測出多數妊娠失敗。

發明內容

為將奶牛受孕檢測時間提前，降低牛場成本，本發明提供了一種基于整合素的表達判斷奶牛人工受精成功與否的方法，包括如下步驟：

步驟S1：于奶牛人工受精后的20天內，每天定期提取人工輸精后的奶牛的血液，或者，僅提取受精后第10天、第13天、第16天及第19天的血液；

步驟S2：從上述血液中提取DNA；

步驟S3：設計αv基因引物和β3基因引物；

步驟S4：利用步驟S3所設計的引物，對步驟S2中提取到的DNA進行PCR擴增；

步驟S5：對擴增后的DNA進行αv基因和β3基因的相對表達量的測定以及αv基因和β3基因蛋白質的表達水平的測定，根據測定結果判斷奶牛是否成功受孕；其中，步驟S5的判斷原則包括：

若第13天的奶牛血液對應的擴增后的DNA相比第10天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其αv基因相對表達量有明顯提高，則奶牛成功受孕，若αv基因相對表達量變化不大，則奶牛未成功受孕。

其中，所述步驟S5中的判斷原則還包括：

若第16天的奶牛血液對應的擴增后的DNA相比第13天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其αv基因相對表達量無明顯變化，則奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液對應的擴增后的DNA相比第13天的奶牛血液對應的擴增后的DNA，其αv基因相對表達量幾乎沒有，則奶牛未成功受孕；