[發(fā)明專利]表達腫瘤相關抗原的細胞及其構建方法與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811580484.6
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN111320701A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 劉韜;李加國;張亞軍;金華君;錢其軍
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療集團有限公司;上海乘黃納米抗體科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/85;C07K5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發(fā)明提供表達腫瘤相關抗原的細胞及其構建方法與應用。所述細胞能夠表達如下融合蛋白：由腫瘤相關抗原或免疫檢查點蛋白或其活性表位、胞外鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)順次連接而成；其中，所述胞外鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)來自于CD8。本發(fā)明成功構建了表達腫瘤相關抗原的細胞，可應用于腫瘤免疫治療領域(特別是CAR?T技術)，一方面，在以表達腫瘤相關抗原的細胞免疫動物制備抗體方面具有較大優(yōu)勢，另一方面，膜表達抗原細胞可用于制備單克隆抗體的檢測篩選。其可作為從細胞水平上驗證靶向腫瘤相關抗原的抗體的親和力的細胞模型。

技術領域

本發(fā)明涉及腫瘤免疫治療領域，具體地說，涉及表達腫瘤相關抗原的細胞及其構建方法與應用。

背景技術

免疫治療(Immunotherapy)是繼手術、放療、化療之后的第四種腫瘤治療方法。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)T細胞技術是新近迅速發(fā)展的一種腫瘤細胞治療技術，CAR-T技術是應用基因改造技術，將一段識別腫瘤抗原的單鏈抗體(singlechain fragment variable,scFv)和胞內(nèi)活化基序重組基因轉(zhuǎn)染至T淋巴細胞上以達到更好的識別及殺傷腫瘤的效果。CAR是一個人工合成的嵌合抗原受體，在結(jié)構上包括腫瘤相關抗原結(jié)合區(qū)(通常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scFv段)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號區(qū)。其中胞外區(qū)為識別腫瘤相關抗原的單克隆抗體可變區(qū)序列(single chain variablefragment，ScFv)；跨膜區(qū)連接胞外區(qū)與胞內(nèi)區(qū)，常用的跨膜區(qū)主要來自于如CD8、CD28或4-1BB等分子的跨膜區(qū)；胞內(nèi)信號區(qū)則主要來自于CD28、4-1BB、或CD27等T細胞傳導信號分子的胞內(nèi)段嵌合體。人們通過分子克隆方法將上述元件在體外進行重組，形成重組質(zhì)粒，通過病毒載體、電穿孔等手段將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導入T細胞并使之表達，這種經(jīng)過基因修飾與改造的T細胞即稱為CAR-T細胞。CAR-T細胞通過ScFV段識別并結(jié)合腫瘤抗原，一旦結(jié)合抗原，CAR的胞內(nèi)段會傳輸活化以及共刺激信號給T細胞，激活的T細胞便有效靶向殺傷腫瘤細胞。

間皮素(mesothelin,MSLN)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤分化抗原。其前體是糖磷脂酰基醇(GPI)錨定的、糖基化的細胞表面蛋白，可被furin蛋白酶水解為31kD的N-末端分泌型蛋白和40kD的C-末端蛋白，后者主要以膜結(jié)合的GPI錨定的形式存在，有限分布于正常間皮細胞及表面上皮細胞，因此命名為間皮素。間皮素在間皮瘤即腫瘤細胞、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和子宮內(nèi)膜癌中優(yōu)勢表達(過表達)。與此相反，其表達在正常細胞例如間皮細胞中受限。間皮素誘導腫瘤發(fā)生的機制可能包括以下三個方面：第一，間皮素可以通過與粘蛋白MUC16(即CA125)相互作用而促進腫瘤細胞的腹膜種植和轉(zhuǎn)移；第二，間皮素能通過NF-κB信號通路促進腫瘤細胞的存活和增殖；最后，間皮素的表達會增強腫瘤細胞對某些特定的藥物的耐受能力。由此可見，間皮素是一個用于腫瘤治療的理想靶標。

雖然已知的許多間皮素單克隆抗體都是可用的，但是沒有一個可以展現(xiàn)出針對于腫瘤細胞的補體依賴性細胞毒性(CDC)。因此，目前靶向間皮素的治療由于缺乏具有強效的CDC的抗間皮素的單克隆抗體而被阻礙。CDC是治療性抗體的重要的細胞殺傷機制。目前認為抗體結(jié)合位點靠近細胞膜時才可能有效介導補體依賴性細胞毒性(CDC)發(fā)生(Pawluczkowycz等，J Immunol 183:749-758，2009)。

Mucin 1是膜結(jié)合型粘蛋白家族成員，簡稱MUC1。在正常情況下，MUC1呈低水平表達在乳腺，胰腺，胃腸道，呼吸道及泌尿生殖道的上皮細胞的近管腔面，不能被機體免疫系統(tǒng)識別，其表達特點為極性表達，頂端分布，糖基化豐富。在大多數(shù)腺癌、血液系惡性腫瘤中MUC1呈異常過表達，可通過調(diào)控多個信號通路調(diào)節(jié)細胞惡性轉(zhuǎn)化，是促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要癌基因。由于MUC1在腫瘤細胞中的表達糖基化不全，并失去極性，遍布于整個細胞表面，容易被抗體識別，因此，MUC1蛋白也可作為CAR-T細胞抗腫瘤治療的一個理想靶點。