[發明專利]表達腫瘤相關抗原的細胞及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201811580484.6
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN111320701A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 劉韜;李加國;張亞軍;金華君;錢其軍
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療集團有限公司;上海乘黃納米抗體科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/85;C07K5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

1.融合蛋白，其特征在于，由腫瘤相關抗原或免疫檢查點蛋白或其活性表位、胞外鉸鏈區和跨膜區順次連接而成；

其中，所述胞外鉸鏈區和跨膜區來自于CD8。

2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述腫瘤相關抗原包括EGFR、Her2、間皮素、MUC1、GPC3；和/或

所述免疫檢查點蛋白包括CTLA4、PD 1、PD-L1的胞外區全長或部分區段。

3.含有權利要求1或2所述融合蛋白的編碼基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括重組DNA、表達盒、轉座子、質粒載體、噬菌體載體、病毒載體或工程菌。

4.表達腫瘤相關抗原的細胞的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、膜表達腫瘤相關抗原的載體的構建；

B、將A構建的載體導入細胞，篩選獲得表達腫瘤相關抗原的細胞；

其中，A構建的載體攜帶有權利要求1或2所述融合蛋白的編碼基因，步驟B所述細胞包括HEK 293、CHO。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)膜表達載體pmexS的構建；

2)膜表達腫瘤相關抗原的載體的構建；

3)利用脂質體轉染法將2)構建的載體導入HEK 293細胞，篩選獲得表達腫瘤相關抗原的細胞；

其中，步驟1)具體如下：

①對pNB328-EGFP載體進行改造

首先，合成如SEQ ID NO:1所示的序列CFL，插入pNB328-EGFP的Asc I和Cla I酶切位點之間，得到pNB338CFL(-)；pNB328-EGFP經EcoR I和Sal I酶切，回收730bp的EGFP片段，插入pNB338CFL(-)的EcoR I和Sal I酶切位點之間得到pNB338CFL-EGFP(-)；之后，去掉HyPBase表達盒；

設計以下引物：

Pr1：5’-CTGATTAATTAACCCTAGAAAGATAGTC-3’

Pr2：5’-CAGTGGCGCGCCTTAACCCTAGAAAGATAATC-3’

以pNB338CFL-EGFP(-)載體為模板進行PCR擴增，擴增產物經Pac I和Asc I雙酶切后插入pNB338CFL-EGFP(-)載體的Pac I和Asc I酶切位點之間，獲得pS338CFL-EGFP；

②載體pS338CFL-CD8sigHTM的構建

設計并合成由CD8信號肽核酸序列、CD8鉸鏈區核酸序列和CD8跨膜區核酸序列依次串聯組成的DNA序列，且在CD8信號肽序列與CD8鉸鏈區序列之間設計一個Afe I酶切位點，將該DNA序列插入載體pS338CFL-EGFP的EcoR I和BamH I酶切位點之間，得到載體pS338CFL-CD8sigHTM；

③載體pmexS的構建

載體pSin-EF2-hLIN28-pur以BamH I和Xho I雙酶切回收1251bp大小的片段，將此片段插入pS338CFL-CD8sigHTM的BamH I和Sal I酶切位點之間，得到載體pmexS；

步驟2)具體如下：將腫瘤相關抗原的編碼基因與經Afe I線性化的載體pmexS連接，得到膜表達腫瘤相關抗原的載體。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟1)所述CD8信號肽核酸序列、CD8鉸鏈區核酸序列和CD8跨膜區核酸序列分別如SEQ ID NO:2-4所示。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟1)所述由CD8信號肽核酸序列、CD8鉸鏈區核酸序列和CD8跨膜區核酸序列依次串聯組成的DNA序列，其核酸序列如SEQ ID NO:23所示。