[發(fā)明專利]一種鑒定雙季茭白早晚熟特性的分子標記及其應用、獲取方法

在審

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• 申請日: 2018-12-21
• 公開（公告）號: CN109439793A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設計）人: 張雅芬;葉子弘;葛鑫濤;夏文強;俞曉平;崔海峰
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種鑒定雙季茭白早晚熟特性的分子標記，其特征在于包括分子標記UeS1、UeS2、UeS3、UeS4、UeS5、UeS6、UeS7和UeS8，所述分子標記UeS1的正向引物UeSNP1-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物UeSNP1-R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述分子標記UeS2的正向引物UeSNP2-F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物UeSNP2-R核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述分子標記UeS3的正向引物UeSNP3-F核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物UeSNP3-R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述分子標記UeS4的正向引物UeSNP4-F核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物UeSNP4-R核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述分子標記UeS5的正向引物UeSNP5-F核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物UeSNP5-R核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述分子標記UeS6的正向引物UeSNP6-F核苷酸序列如SEQID NO.11所示，反向引物UeSNP6-R核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述分子標記UeS7的正向引物UeSNP7-F核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物UeSNP7-R核苷酸序列如SEQID NO.14所示；所述分子標記UeS8的正向引物UeSNP8-F核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物UeSNP8-R核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

2.如權利要求1所述的分子標記在茭白育種中的應用。

3.如權利要求1所述的分子標記在茭白育種中鑒定雙季茭白早晚熟特性中的應用。

4.如權利要求1所述的分子標記的獲得方法，其特征在于包括以下步驟：

a、雙季茭白早晚熟特性的鑒定：選取不同地區(qū)不同熟性的茭白品種并記錄；

b、群體分析

1)分離培養(yǎng)茭白中的菰黑粉菌；

2)CTAB法提取菰黑粉菌基因組DNA；

3)將47個確定熟性雙季茭白的菰黑粉菌基因組DNA進行基因組二代重測序；

4)掃描得到所有SNP；

5)篩選出在雙季早熟茭白菰黑粉菌和雙季晚熟茭白菰黑粉菌的差異SNP位點；

6)選取48個采集自不同地區(qū)的雙季茭白分離菰黑粉菌對篩選得到的SNP位點進行驗證；

c、使用其他具有早晚熟特性的雙季品種鑒定篩選的SNP位點并獲得圖譜；共獲得8對具有早晚熟篩選特性的分子標記UeS1、UeS2、UeS3、UeS4、UeS5、UeS6、UeS7和UeS8。

5.如權利要求4所述的獲得方法，其特征在于步驟a中茭白早晚熟特性的鑒定具體為：從浙江省桐鄉(xiāng)市、浙江省金華市、浙江省縉云縣、浙江省余姚市、浙江省杭州市以及江蘇省蘇州市搜集不同品種的茭白并記錄采收期和

茭重，對一些經(jīng)典品種按品種審定時確定的熟性認定；采收時選取茭形完整、個頭中等、茭葉無病害的茭白。

6.如權利要求4所述的獲得方法，其特征在于步驟b的1)中分離培養(yǎng)茭白中的菰黑粉菌具體為：

a、將茭白莖部加無菌水磨碎；

b、涂布至含羧芐青霉素和卡那霉素的YEPS培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-6d。

7.如權利要求4所述的獲得方法，其特征在于步驟b的5)中篩選出在早熟茭白菰黑粉菌和晚熟茭白菰黑粉菌的差異SNP位點具體為：

a、將所有SNP數(shù)據(jù)標記為A、B、C三類，代表早熟、中熟、晚熟三個特性；

b、計算機自動識別A、B、C三類所有的SNP并歸類；輸出格式為Genotyping*simple-A/B/C.txt.；數(shù)據(jù)內(nèi)容為SNP_site a/b,a代表具有該SNP的個數(shù)，b代表一類的總個數(shù)；

c、將數(shù)據(jù)復制至Excel工作表，使用篩選功能，選取只在A類中為1，C類中為0的SNP。

8.如權利要求4所述的獲得方法，其特征在于步驟b的6)中選取48個采集自不同地區(qū)的茭白分離菰黑粉菌對篩選得到的SNP位點進行驗證具體包括：

a、將48個采集自不同地區(qū)的茭白進行研磨分離；

b、提取全部菰黑粉菌基因組DNA；

c、針對獲得的SNP數(shù)據(jù)設計AS-PCR引物；

d、選取典型早晚熟特性的茭白菰黑粉菌DNA進行AS-PCR驗證，驗證獲得16個具有多態(tài)性的SNP位點；針對這16個SNP位點設計HRM檢測擴增引物；

e、將48個茭白菰黑粉菌DNA用16對HRM引物擴增，PCR產(chǎn)物用于HRM檢測；

f、用不同顏色的曲線標記早晚熟特性。