[發(fā)明專利]一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811569892.1
• 申請(qǐng)日: 2018-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109486883B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉平祥;陳嫦青;劉金萍;陸應(yīng)誠(chéng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東驅(qū)動(dòng)力生物科技股份有限公司;廣東三行生物科技有限公司;廣州三行生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12P21/02;C12R1/91
• 代理公司: 廣州圣理華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44302
• 代理人: 李唐明;頓海舟

本發(fā)明提供一種制備L?丙氨酰?L?谷氨酰胺的方法，包括以下步驟：S1.過(guò)表達(dá)SLC1A5的HEK293T穩(wěn)定細(xì)胞系的獲??；S2.向獲取的細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lal，培養(yǎng)24小時(shí)；S3.向轉(zhuǎn)染Lal后的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入丙氨酸和谷氨酰胺；S4.收集S3中的細(xì)胞裂解液，并提取L?丙氨酰?L?谷氨酰胺。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單快速，污染小，綠色環(huán)保，從提高反應(yīng)底物濃度和生物反應(yīng)器數(shù)目?jī)煞矫鎭?lái)提高該酶促反應(yīng)的效率，可提高L?丙氨酰?L?谷氨酰胺的產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法。

背景技術(shù)

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺屬于氨基酸的衍生物，分子式為C₈H₁₅N₃O₄，分子量為217，是目前國(guó)內(nèi)外比較熱門的氨基酸二肽產(chǎn)品，簡(jiǎn)稱丙谷二肽，它是腸外營(yíng)養(yǎng)的一個(gè)組成部分，適用于需要補(bǔ)充谷氨酰胺的病人，包括處于分解代解和高代謝狀況的病人，是人體含量最豐富的氨基酸谷氨酰胺的理想替代品，因此在保健品和藥用領(lǐng)域非常廣泛。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶解度很高，是同樣條件下游離谷氨酰胺的200倍，而且性質(zhì)穩(wěn)定，在不同的pH值條件下加熱滅菌也不會(huì)產(chǎn)生有毒的焦谷氨酸和氨產(chǎn)生，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺進(jìn)入機(jī)體之后，被許多器官組織中的二肽酶快速有效地分解為丙氨酸和谷氨酰胺，滿足機(jī)體的需求，無(wú)任何毒副反應(yīng)。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的半衰期極短，約3.8分鐘，并且進(jìn)入機(jī)體后僅有微量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺從尿中排出，這表明L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可被機(jī)體有效地利用，避免了因L-丙氨酰-L-谷氨酰胺積蓄可能引起的損傷，因此L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在臨床上受到了廣泛的應(yīng)用。

目前，生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法以及微生物轉(zhuǎn)化法。由于化學(xué)合成法在合成過(guò)程中需要引入和去除保護(hù)基團(tuán)，合成步驟過(guò)多，成本過(guò)高，并且需要用到有毒試劑，不適合工業(yè)生產(chǎn)；微生物發(fā)酵法成本低廉，環(huán)境溫和，但是產(chǎn)量較低，離大規(guī)模生產(chǎn)還有一定距離；隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展以及微生物資源的發(fā)現(xiàn)，使得微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成為工業(yè)上很有前景的生產(chǎn)方法。其中微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺大多采用大腸桿菌作為生物反應(yīng)器進(jìn)行酶法合成，但其有個(gè)明顯的的缺點(diǎn)：過(guò)表達(dá)Lal(L-型氨基酸連接酶，L-amino acid α ligase)大腸桿菌的存活率低，導(dǎo)致最終的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺產(chǎn)量低。

專利申請(qǐng)CN104480172A公開(kāi)了一種利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，通過(guò)將具有氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的基因片段重組到載體上并轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞，得到的具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成活性的重組微生物。上述方案雖然一定程度上增加了L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的產(chǎn)量，但未考慮大腸桿菌的存活率及酶反應(yīng)過(guò)程中的底物從濃度問(wèn)題，從而使該反應(yīng)的效率低下。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，考慮提高酶促反應(yīng)最重要的條件之一底物濃度，來(lái)提高反應(yīng)效率，從而提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的產(chǎn)量。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，包括以下步驟：

S1.過(guò)表達(dá)SLC1A5的HEK293T穩(wěn)定細(xì)胞系的獲??；

S2.向獲取的細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lal，培養(yǎng)24小時(shí)；

S3.向轉(zhuǎn)染Lal后的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入丙氨酸和谷氨酰胺，反應(yīng)2-4小時(shí)，離心收集細(xì)胞，然后將細(xì)胞破碎，離心，獲取細(xì)胞裂解液；

S4.收集S3中的細(xì)胞裂解液，并提取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。