[發(fā)明專利]一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811569892.1
• 申請日: 2018-12-21
• 公開（公告）號: CN109486883B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發(fā)明（設計）人: 劉平祥;陳嫦青;劉金萍;陸應誠
• 申請（專利權）人: 廣東驅(qū)動力生物科技股份有限公司;廣東三行生物科技有限公司;廣州三行生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12P21/02;C12R1/91
• 代理公司: 廣州圣理華知識產(chǎn)權代理有限公司 44302
• 代理人: 李唐明;頓海舟

1.一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.過表達SLC1A5的HEK293T穩(wěn)定細胞系的獲取；

S2.向獲取的細胞轉染Lal，培養(yǎng)24小時；

S3.向轉染Lal后的細胞培養(yǎng)基中加入丙氨酸和谷氨酰胺，反應2-4小時，離心收集細胞，然后將細胞破碎，離心，獲取細胞裂解液；

S4.收集S3中含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的細胞裂解液，并提取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

2.根據(jù)權利要求1所述一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，S2所述細胞轉染Lal的操作步驟如下：

S1.當HEK293T細胞生長狀態(tài)良好且貼壁細胞密度達到50-70％即可進行轉染；

S2.轉染前1h換液，移去舊培養(yǎng)基加入9mL新鮮無抗培養(yǎng)基；

S3.取一干凈的2mL離心管，依次加入滅菌去離子水和10μg質(zhì)粒，使終體積達到450μL，加入50μL CaCl₂，使三者混合均勻，將500μL的2×HBSS緩慢滴加至上述溶液中，邊滴加邊搖勻；

S4.取出細胞培養(yǎng)皿，加入5μL氯喹，然后緩慢加入S3混合好的轉染液，輕輕搖勻，放回細胞培養(yǎng)箱。

3.根據(jù)權利要求2所述一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒為去內(nèi)毒素質(zhì)粒，所述質(zhì)粒的構建過程包括制備線性化載體、插入片段擴增引物設計及插入片段PCR擴增、PCR產(chǎn)物的酶切及回收、進行重組反應、反應產(chǎn)物轉化、涂板、克隆鑒定、去內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取。

4.根據(jù)權利要求3所述一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述線性化載體根據(jù)pcDNA3質(zhì)粒圖譜，選定Hind III和EcoRI兩個酶切位點進行酶切制備得到。

5.根據(jù)權利要求4所述一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述線性化載體制備具體過程為：向PCR管中加入Hind III 1μL、EcoRI 1μL、10×K Buffer 2μL、空載體10μL，添加ddH₂O補至終體積為20μL，37℃酶切5h。

6.根據(jù)權利要求3所述一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述PCR擴增引物為

上游引物：

5’-GATTACAAGGACGACGATGACAAGACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATTAGCATTTTAATA-3’；

下游引物：5’-TATGACCATGATTACGAATTCTTATTTGAGAGAACA-3’。

7.根據(jù)權利要求3所述一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為：95℃預變性5min，95℃變性10s，59℃退火5s，72℃延伸1min；以上步驟循環(huán)35次，然后72℃末尾延伸5min，4℃保存。

8.根據(jù)權利要求3所述一種制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，S1所述過表達SLC1A5的HEK293T穩(wěn)定細胞系通過細胞電轉，然后G418篩選后獲得。