[發(fā)明專利]基于單分子力譜探測核酸末端結(jié)構(gòu)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811567669.3
• 申請日: 2018-12-21
• 公開（公告）號: CN109852667B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于仲波;李寧;王軍力;馬康康;梁琳
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;G01N33/48
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙尊生

本發(fā)明涉及一種基于單分子力譜探測核酸末端結(jié)構(gòu)的方法，具體是一種用于探測核酸自由末端高級結(jié)構(gòu)的單分子力譜方法，屬于生物大分子高級結(jié)構(gòu)的力學(xué)精密測量領(lǐng)域。首先通過結(jié)合反應(yīng)將攜帶修飾基團(tuán)的待測核酸鏈錨定于DNA單鏈引物上，生成分叉引物；其次通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備攜帶待測核酸鏈的DNA以及救生繩DNA片段；再次通過酶切連接生成攜帶多條待測核酸的救生繩DNA結(jié)構(gòu)物，并將其固定于兩個表面之間；最后使用單分子力譜探測待測核酸自由末端形成的高級結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。本發(fā)明設(shè)計的救生繩DNA，主要用于重復(fù)、主動、精密和實時測量核酸末端高級結(jié)構(gòu)，拓展了單分子力譜的應(yīng)用范圍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于單分子力譜探測核酸末端結(jié)構(gòu)的方法，具體是一種用于探測核酸自由末端高級結(jié)構(gòu)的單分子力譜方法，屬于生物大分子二級以上三維構(gòu)象或高級結(jié)構(gòu)的力學(xué)精密測量領(lǐng)域。

背景技術(shù)

核酸自由末端的高級結(jié)構(gòu)動態(tài)組裝研究是RNA結(jié)構(gòu)與功能、染色質(zhì)損傷修復(fù)通路以及端粒生物學(xué)領(lǐng)域的重要內(nèi)容。如果能夠精密、實時、主動和可重復(fù)探測核酸自由末端的高級結(jié)構(gòu)的分子動態(tài)，就可以預(yù)測RNA加工、染色質(zhì)損傷的修復(fù)和易位，以及染色體數(shù)目異常等細(xì)胞事件，從而深入理解核酸相關(guān)疾病或者端粒綜合征的病理生理過程和分子生物學(xué)機制。目前可用于核酸自由末端高級結(jié)構(gòu)動態(tài)組裝研究的主要實驗手段有：雙向凝膠電泳、熒光原位雜交、電鏡、超分辨顯微鏡、原子力顯微鏡和單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移等。其中電泳和雜交等技術(shù)方法能夠分離核酸高級結(jié)構(gòu)的不同構(gòu)象，并且探測核酸自由末端形成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但是無法達(dá)到精密的時空分辨率，也無法對大分子施加外部能量進(jìn)行可重復(fù)的主動探測。電鏡、超分辨顯微鏡和原子力顯微鏡可以對眾多大分子進(jìn)行精密成像，通過多樣本統(tǒng)計進(jìn)而分析高級結(jié)構(gòu)的非均一組份，但是無法進(jìn)行實時監(jiān)測，也無法進(jìn)行可重復(fù)的主動探測。單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移可以高通量探測核酸自由末端的動態(tài)構(gòu)象變化，實現(xiàn)毫秒時間分辨率，但是熒光共振能量轉(zhuǎn)移的適用距離是1-10納米，不能探測大尺度的分子構(gòu)象動態(tài)，也無法對目標(biāo)分子施加外力進(jìn)行可重復(fù)的主動探測。

單分子力譜是精密、實時、主動、重復(fù)探測大分子多態(tài)構(gòu)象變化的最有效手段之一。常用的單分子力譜技術(shù)有光鑷、原子力顯微鏡和磁鑷等。單分子力譜可以表征多態(tài)大分子的非均一構(gòu)象，尤其是超出熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測距離的長鏈核酸或蛋白。單分子力譜通常能夠以毫秒和納米的時空分辨率探測分子的動態(tài)變化。更重要的是，單分子力譜可對目標(biāo)分子施加外力，從而進(jìn)行主動探測。單分子力譜目前僅有重復(fù)探測末端固定的核酸結(jié)構(gòu)的實驗方案，沒有簡便易行的可重復(fù)探測核酸自由末端高級結(jié)構(gòu)動態(tài)的實驗方法。

中國專利CN200710065562.4公開了一種結(jié)合磁鑷觀測生物大分子的全反射近場顯微鏡，在高分辨率、高精度下實時快速的觀察生物大分子。到目前為止，基于單分子力譜探測核酸末端動態(tài)的結(jié)構(gòu)的方法未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于單分子力譜探測核酸末端結(jié)構(gòu)的方法，可以精密、實時、主動和可重復(fù)探測核酸自由末端高級結(jié)構(gòu)。通過結(jié)合反應(yīng)，合成攜帶待測核酸序列的分叉引物，然后使用分叉引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而可將兩條以上的待測核酸序列錨定于DNA救生繩結(jié)構(gòu)上。多條核酸鏈的自由末端相互作用，形成待測高級結(jié)構(gòu)。通過親和反應(yīng)，將攜帶待測核酸鏈的DNA救生繩結(jié)構(gòu)物固定于兩個表面之間。通過對救生繩施加外力，從而獲得待測核酸高級構(gòu)象變化的力學(xué)動態(tài)軌跡。以軌跡的空間變量作為外力或者時間的函數(shù)，本發(fā)明可用于探測核酸自由末端高級結(jié)構(gòu)的動態(tài)機制。

本發(fā)明提供的基于單分子力譜探測核酸末端結(jié)構(gòu)的方法具體包括如下步驟：

1）待測核酸鏈的一端攜帶能進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)的修飾基團(tuán)，用于錨定在DNA救生繩上；無修飾的另一端為核酸的自由末端，將形成待探測的結(jié)構(gòu)；DNA引物中間位置的修飾基團(tuán)與待測核酸鏈進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)物是分叉引物；

2）分叉引物經(jīng)分離、純化后用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；

3）救生繩DNA片段為不攜帶待測核酸鏈的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物；