[發明專利]基于單分子力譜探測核酸末端結構的方法

有效

• 申請號: 201811567669.3
• 申請日: 2018-12-21
• 公開（公告）號: CN109852667B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 于仲波;李寧;王軍力;馬康康;梁琳
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;G01N33/48
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙尊生

1.一種基于單分子力譜探測核酸末端結構的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）待測核酸鏈的一端攜帶能進行結合反應的修飾基團，用于錨定在DNA救生繩上；無修飾的另一端為核酸的自由末端，將形成待探測的結構；DNA引物中間位置的修飾基團與待測核酸鏈進行結合反應，產物是分叉引物；

2）分叉引物經分離純化后用于聚合酶鏈式反應；

3）救生繩DNA片段為不攜帶待測核酸鏈的聚合酶鏈式反應產物；

4）救生繩結構物終產物的制備是將攜帶待測核酸的聚合酶鏈式反應產物與救生繩DNA片段相間排列，使用連接酶進行共價連接，位于結構物終產物兩端的救生繩片段攜帶親和性修飾，用于在探測表面錨定結構物；所述的探測表面是微球表面、玻璃表面、原子力顯微鏡探針或基底表面；

5）單分子力譜對錨定于兩個表面之間的救生繩DNA結構物施加外力，探測待測核酸形成的高級結構，收集包含三維空間位置、力和時間的軌跡數據。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1）所述的結合反應是點擊化學、酶促連接或者親和結合。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2）所述的聚合酶鏈式反應的引物之一為分叉引物，攜帶待測核酸單鏈。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3）所述的救生繩DNA片段的數目大于待測核酸鏈條數；救生繩DNA片段長于其構象持續長度或相關長度，也要長于待測核酸多態構象的最大長度。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4）所述的救生繩結構物，其兩端的親和性修飾是單位點或者多位點修飾。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的單位點或者多位點修飾用生物素或地高辛；所述救生繩結構物的共價連接選用T4 DNA連接酶。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5）所述的單分子力譜是磁鑷、光鑷或原子力顯微鏡，實驗數據包括三維空間位置、力和時間。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待測核酸形成的高級結構是但不限于T-loop、D-loop或R-loop。