[發(fā)明專利]一種甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811564966.2
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109444287B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陶保華;吳建國;邢嘉琪;邰可可;陳啟
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州同創(chuàng)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 33295 杭州知見專利代理有限公司
• 代理人: 趙越劍

1.一種非診斷目的甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1樣本預(yù)處理：取樣本，加入碳酸氫銨溶液、內(nèi)標(biāo)儲備液、二硫蘇糖醇溶液，在水浴中還原， 然后加入碘代乙酰胺溶液，于室溫黑暗處靜置，接著加入胰蛋白酶酶解，最后加入甲酸，終止酶解反應(yīng)；

S2：酶解產(chǎn)物上液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定；

S3： 根據(jù)公式計(jì)算獲得甲胎蛋白含量；其中G代表樣本中甲胎蛋白含量，C為樣本中特異肽濃度，M_甲胎蛋白代表甲胎蛋白的分子量，M_特異肽代表特異肽的分子量；

所述內(nèi)標(biāo)儲備液為同位素標(biāo)記的特異肽的水溶液，所述同位素標(biāo)記的特異肽的氨基酸序列為：NI*FL*ASFVHEYSR，其中I*代表同位素標(biāo)記的異亮氨酸，L*代表同位素標(biāo)記的亮氨酸；所述特異肽的氨基酸序列為NIFLASFVHEYSR；

S2中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的液相條件為：

色譜柱：Waters BEH 300 C₁₈ ，規(guī)格100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm；

柱溫：40℃；樣品溫度：室溫；

流動相：流動相A：含0.1 %甲酸的水溶液；流動相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液；

色譜分離梯度條件：在5分鐘內(nèi)將流動相B含量從3 %提升至32 %；

流速：0.3mL /min；

進(jìn)樣體積：5 μL；

質(zhì)譜檢測條件如下：ESI+離子源，毛細(xì)管電壓：3.0kv，錐孔電壓：15 V，脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：900L/min，錐孔反吹氣流量：150L/hr，碰撞室壓力：3 .0×10^-3 mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15 .0V，離子能量1：0 .5eV；低端分辨率2：2 .8V，高端分辨率2：15 .0 V，離子能量2：1.0 eV；離子源溫度：150℃，提取器電壓：3.0V；監(jiān)測模式采用多反應(yīng)檢測模式MRM。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非診斷目的甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法，其特征在于：所述內(nèi)標(biāo)儲備液的濃度為1 μg/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非診斷目的甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法，其特征在于：S1樣本處理具體為：取0.5 mL樣本，加入0.665 mL碳酸氫銨溶液、100 μL內(nèi)標(biāo)儲備液、10 μL二硫蘇糖醇溶液，在50℃水浴中還原30分鐘，然后加入10 μL碘代乙酰胺溶液，于室溫黑暗處靜置30分鐘，加入10 μL胰蛋白酶，在37℃水浴中酶解過夜，最后加入5 μL濃甲酸，終止酶解反應(yīng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種非診斷目的甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法，其特征在于：所述濃甲酸為濃度在95%以上。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非診斷目的甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法，其特征在于：碳酸氫銨溶液濃度為500mmol/L，二硫蘇糖醇溶液濃度為100mmol/L，碘代乙酰胺溶液濃度為300 mmol/L。