[發(fā)明專利]一種甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811564966.2
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109444287B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陶保華;吳建國;邢嘉琪;邰可可;陳啟
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州同創(chuàng)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 33295 杭州知見專利代理有限公司
• 代理人: 趙越劍

本發(fā)明公開了一種甲胎蛋白的LC?MS/MS定量檢測方法，包括如下步驟：S1樣本預(yù)處理：取樣本，加入碳酸氫銨溶液、內(nèi)標(biāo)儲備液、二硫蘇糖醇溶液，在水浴中還原，然后加入碘代乙酰胺溶液，于室溫黑暗處靜置，接著加入胰蛋白酶酶解，最后加入甲酸，終止酶解反應(yīng)；S2：酶解產(chǎn)物上液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定；S3：根據(jù)公式計(jì)算獲得甲胎蛋白含量。本發(fā)明檢測的準(zhǔn)確性高、可靠性強(qiáng)、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種甲胎蛋白的檢測方法，特別涉及一種甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法。

背景技術(shù)

目前，惡性腫瘤已經(jīng)排在我國居民主要疾病死亡率的首位，成為影響人們健康的頭號殺手。根據(jù)我國衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國每年新發(fā)癌癥病例約337萬，死亡約211萬。肝癌已經(jīng)成為僅次于胃癌的第二大癌癥。作為一種高死亡率的疾病，肝癌的病因、發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及診斷和治療都越來越引起人們的關(guān)注。肝癌的癥狀在早期很不明顯，甚至患者在患病后較長時(shí)間毫無感覺，待病情發(fā)展到一定程度才會逐步產(chǎn)生一些肝區(qū)疼痛、食欲下降、疲憊無力、日漸消瘦等癥狀。到晚期則會有黃疸、腹水、嘔血、昏迷等表現(xiàn)。肝癌病人的上腹部可摸到巨大的腫塊，但此時(shí)已到中晚期，甚至已向肺部等處轉(zhuǎn)移。肝癌總的病程大約2年半時(shí)間，其中2年時(shí)間都是處于沒有癥狀的早期階段，一旦出現(xiàn)癥狀就只有半年的存活時(shí)間。所以早期診斷成為防治肝癌的最有效的手段之一。

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明：80％以上早期惡性腫瘤可得到有效控制。越早確診，腫瘤的治愈率就越高。

臨床診斷腫瘤的方法可分為物理學(xué)、組織細(xì)胞學(xué)及生物化學(xué)三大類。常規(guī)的物理診斷如X光、CT、核磁共振、B超、紅外掃描等只能發(fā)現(xiàn)直徑1-2cm以上的腫塊，而一個(gè)腫瘤倍增至如此大小約需5年甚至更長時(shí)間。細(xì)胞病理學(xué)的檢查需要物理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過手術(shù)取得標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)。因?yàn)椋锢碓\斷和組織細(xì)胞學(xué)診斷往往只能發(fā)現(xiàn)中晚期病理，難以達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)的目的。生物化學(xué)方法是檢測腫瘤生長的多種蛋白等分子標(biāo)記，該方法對腫瘤的早期診斷、觀察評價(jià)治療效果及判斷預(yù)后具有極大意義。

目前，甲胎蛋白是肝癌早期診斷的唯一的金標(biāo)準(zhǔn)，定期檢測甲胎蛋白可以起到預(yù)防肝癌的作用。同時(shí)，可以作為肝癌手術(shù)前后的指標(biāo)，進(jìn)行后期的跟蹤。在大中型醫(yī)院中，甲胎蛋白的檢測多是以基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法為主。該方法通量大，檢測自動化程度高，但是缺點(diǎn)是檢測準(zhǔn)確度偏低，常受到血液中其它物質(zhì)的干擾而產(chǎn)生假陰性或者假陽性結(jié)果，導(dǎo)致肝癌早期診斷結(jié)果錯(cuò)誤。該方法需要抗體作為主要原料，抗體生產(chǎn)批間穩(wěn)定性差，也是導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定的重要因素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法，準(zhǔn)確性高、可靠性強(qiáng)、重復(fù)性好。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種甲胎蛋白的LC-MS/MS定量檢測方法，包括如下步驟：

S1樣本預(yù)處理：取樣本，加入碳酸氫銨溶液、內(nèi)標(biāo)儲備液、二硫蘇糖醇溶液，在水浴中還原，然后加入碘代乙酰胺溶液，于室溫黑暗處靜置，接著加入胰蛋白酶酶解，最后加入甲酸，終止酶解反應(yīng)；

S2：酶解產(chǎn)物上液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定；

S3：根據(jù)公式計(jì)算獲得甲胎蛋白含量；其中G代表樣本中甲胎蛋白含量，C為樣本中特異肽濃度，M_甲胎蛋白代表甲胎蛋白的分子量，M_特異肽代表特異肽的分子量。

本發(fā)明的方法為先對甲胎蛋白進(jìn)行酶解，利用酶解產(chǎn)生的特異肽，通過測定特異肽的濃度，從而計(jì)算獲得甲胎蛋白含量。本發(fā)明的方法有別于傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法，檢測的準(zhǔn)確性高、可靠性強(qiáng)、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好。

所述內(nèi)標(biāo)儲備液為同位素標(biāo)記的特異肽的水溶液，所述同位素標(biāo)記的特異肽的氨基酸序列為：NI*FL*ASFVHEYSR，其中I*代表同位素標(biāo)記的異亮氨酸，L*代表同位素標(biāo)記的亮氨酸。