[發(fā)明專利]基于卡他莫拉菌表面蛋白的乳膠微球免疫層析試紙的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811564952.0
• 申請(qǐng)日: 2018-12-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110540594B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊波;張秋;胡征;王毅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C07K16/12;C12N15/62;C12N15/70;G01N33/543;G01N33/558;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒

本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)卡他莫拉菌的乳膠免疫層析試紙條的制備方法，該試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC板組成，結(jié)合墊上噴涂有彩色乳膠微球偶聯(lián)的抗卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗體，硝酸纖維素膜上包被有抗卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗體的檢測(cè)線和羊抗兔IgG抗體的質(zhì)控線。當(dāng)加入的樣品中含有卡他莫拉菌時(shí)，卡他莫拉菌首先與乳膠?兔抗卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗體形成復(fù)合物，在毛細(xì)作用下遷移至包被有卡他莫拉菌表面蛋白多克隆抗體的檢測(cè)線時(shí)被捕捉，檢測(cè)線呈相應(yīng)的彩色，因而可檢測(cè)樣品中是否含有卡他莫拉菌。該試紙條具有快速、簡(jiǎn)捷、靈敏度高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于卡他莫拉菌表面蛋白的乳膠微球免疫層析試紙的制備方法。

背景技術(shù)

卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis，簡(jiǎn)稱MC)首次發(fā)現(xiàn)于1896年，當(dāng)時(shí)稱之為卡他微球菌(Micrococcus catarrhalis)，爾后又稱為卡他奈瑟菌(Neisseria catarrhalis)和卡他布蘭漢菌(Branhamella catarhalis)。過(guò)去一直認(rèn)為卡他莫拉菌是對(duì)人體無(wú)致病性的上呼吸道正常寄居菌。但是，近20多年的研究發(fā)現(xiàn)，該菌不僅可以引起兒童和老年人的上呼吸道感染，而且還是引起成人下呼吸道感染的重要病原菌，是兒童上頜竇炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最常見(jiàn)致病菌，僅次于流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌，而且其發(fā)病率逐年增加，尤其多見(jiàn)于慢性阻塞性肺病患者。隨著抗生素、激素及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，使人體寄生菌與宿主之間的關(guān)系發(fā)生了變化，院內(nèi)感染率明顯增加。由于肺部感染的致病菌與患者口咽部寄居的菌群密切相關(guān)，所以卡他莫拉菌可在條件適宜時(shí)致病。慢性阻塞性肺病患者久病體弱，長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素和激素，呼吸道防御功能及機(jī)體免疫力降低，使細(xì)菌進(jìn)入下呼吸道而引起感染。

目前檢測(cè)呼吸道中該病原體的方法主要以傳統(tǒng)方法為主，即分離鑒定法，該方法所需時(shí)間長(zhǎng)，一般要2-3天，很難滿足快速鑒定的需要；近幾年發(fā)展起來(lái)的PCR技術(shù)，是一種快速、靈敏、特異性好的技術(shù)，但是目前該技術(shù)還是依賴于傳統(tǒng)方法的前增菌步驟，而增菌液中往往還有PCR抑制劑，從而影響擴(kuò)增的效果。同時(shí)，該技術(shù)還需要專業(yè)的檢測(cè)設(shè)備，不適合進(jìn)行床旁檢測(cè)。以抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)已成為人體病原微生物檢測(cè)不可或缺的重要技術(shù)手段。目前已發(fā)展了多種特異性免疫檢測(cè)技術(shù)，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反應(yīng)、免疫凝集反應(yīng)、ELISA檢測(cè)試劑盒、免疫膠體金試紙條、免疫乳膠檢測(cè)試劑等。其中免疫乳膠試紙條等多種以抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，以其簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)用的特點(diǎn)已成為病原微生物檢測(cè)不可或缺的重要手段。因而，研究開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的病原微生物的抗體，是開(kāi)發(fā)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ELISA檢測(cè)方法、乳膠微球標(biāo)記檢測(cè)法等的基礎(chǔ)。

抗原成分的選擇是制備高特異性抗體的關(guān)鍵?？ㄋ鶰35、McaP、OlpA及OmpCD蛋白均是位于細(xì)胞表面的重要分子，其保守性高，特異性強(qiáng)，抗原性強(qiáng)，表面暴露性高，是較為理想的檢測(cè)標(biāo)的物。本研究選用具有種間特異性的表面蛋白M35、McaP、OlpA及OmpCD等作為抗原，制備特異性良好的多克隆抗體，并將其應(yīng)用于制備卡他莫拉菌乳膠微球免疫層析檢測(cè)試紙條。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是以多克隆抗體為基礎(chǔ)，通過(guò)免疫乳膠標(biāo)記技術(shù)研制一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉、快捷迅速的檢測(cè)卡他莫拉菌的乳膠微球免疫層析檢測(cè)試紙條。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種基于卡他莫拉菌表面蛋白的乳膠微球免疫層析試紙的制備方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

1)卡他莫拉菌表面蛋白(M35+McaP)抗體制備：