[發明專利]基于卡他莫拉菌表面蛋白的乳膠微球免疫層析試紙的制備方法

有效

• 申請號: 201811564952.0
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN110540594B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 楊波;張秋;胡征;王毅
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K16/12;C12N15/62;C12N15/70;G01N33/543;G01N33/558;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 余曉雪;王敏鋒

1.一種卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP，其特征在于：所述卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP的蛋白質序列是：

MEDTNESGLNSNTSRIGFKGSEALNANTDVVYQLEYKIDIDADRGDNFKSRDTYLGLAHKQYGTLLAGRLTTIDDSVDFASMLEDNNVADIGPTFNAPRANNAFAYVSPEYNGTQFLAMYAFDSDTDKGGLAKDDQFGVGATYSTGPINAGATYIHYGDDSHIRLGGSGGSGGSGGSQDYHLSDSITADVKQTGIGLYHRHDFDHLRISANLGVDHLSTQSLRQIMWDGENRNHQAHATGQRRYASVQGSYGFTQNNVTYRPYVGIHAQDIKQNRFFENQPNLSTALSFKLPDHQSLQADIGVNIDYAMNDKLNLLAGLGYQHEFKDNNKTVETAVLSNRDYHRSFVTTVPFDKKHTTHAHLGATLALGNNTHL；

用于編碼卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP的蛋白質的基因全序列是：

2.一種用于制備如權利要求1所述的卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP的方法，其特征在于：所述方法是：

獲取卡他莫拉菌表面蛋白M35及表面蛋白McaP胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段并找到該肽段基因編碼序列；優化肽段基因編碼序列，并將優化后的肽段基因編碼序列用柔性連接肽的編碼序列進行連接，形成融合基因；

所述卡他莫拉菌表面蛋白M35及表面蛋白McaP在NCBI蛋白質數據庫中的accessionnumber分別為AY905613及EF075940；

所述柔性連接肽的序列是ggsggsggsggs；

同時在該融合基因的5’引入酶切位點NdeI、3’端引入終止信號TAA和酶切位點BamHI后化學合成全基因序列，記為m35mac；

所述m35mac的基因全序列是：

所述m35mac基因編碼的蛋白質序列是：

MEDTNESGLNSNTSRIGFKGSEALNANTDVVYQLEYKIDIDADRGDNFKSRDTYLGLAHKQYGTLLAGRLTTIDDSVDFASMLEDNNVADIGPTFNAPRANNAFAYVSPEYNGTQFLAMYAFDSDTDKGGLAKDDQFGVGATYSTGPINAGATYIHYGDDSHIRLGGSGGSGGSGGSQDYHLSDSITADVKQTGIGLYHRHDFDHLRISANLGVDHLSTQSLRQIMWDGENRNHQAHATGQRRYASVQGSYGFTQNNVTYRPYVGIHAQDIKQNRFFENQPNLSTALSFKLPDHQSLQADIGVNIDYAMNDKLNLLAGLGYQHEFKDNNKTVETAVLSNRDYHRSFVTTVPFDKKHTTHAHLGATLALGNNTHL；

所述m35mac基因編碼的蛋白質序列為卡他莫拉菌表面蛋白M35的50-213aa及表面蛋白McaP的429-625aa；兩段蛋白序列中間以柔性連接肽進行連接；將通過柔性連接肽連接得到的基因片段按常規方法克隆入原核表達載體pET-28a(+)，轉化大腸桿菌TOP10，構建pET-M35mac表達載體，將鑒定正確的陽性克隆菌培養后提取質粒，按常規技術轉入感受態E.coli BL21(DE3)中，轉化完成后將菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常規方法篩選表達菌株，用IPTG誘導重組大腸桿菌表達，用Ni²⁺親和層析法純化重組M35mac蛋白。

3.一種用于制備卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP抗體的方法，其特征在于：所述方法是將如權利要求2所述的重組M35mac蛋白作為免疫抗原，與弗氏佐劑混合后反復人工免疫健康的新西蘭大白兔，抽血進行效價測定，分離高效價重組蛋白抗體并進行純化，最終獲得卡他莫拉菌表面蛋白M35+McaP抗體。