[發明專利]一種高效制備甘草次酸的重組酶及方法

有效

• 申請號: 201811564903.7
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109628427B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 李春;馮旭東;呂波
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12P33/00;C12R1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 向群

本發明“一種高效制備甘草次酸的重組酶及方法”，屬于酶工程領域。所述重組酶包括來源于土曲霉的β?葡萄糖醛酸苷酶AtGUS的TIM桶結構域、及來源于米曲霉的β?葡萄糖醛酸苷酶PGUS的糖基結構域SBD和免疫球蛋白狀β?三明治結構域IMD。該重組酶AtGUS?mix性狀優良，60℃下的熱穩定性比野生酶AtGUS高550％，且比酶活比野生酶AtGUS和PGUS分別高2和6.9倍。重組酶AtGUS?mix的底物轉化率達到95.06％，GA的收率達到98.82％。產物GA終濃度為19.22mM，是野生酶PGUS的5.7倍、AtGUS的2.6倍。

技術領域

本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種高效制備甘草次酸的重組酶及方法。

背景技術

甘草是我國最常用的中藥材之一，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳等功效。其天然提取物甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)均具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理作用，廣泛用于保肝護肝、抗癌等領域，同時也被廣泛的應用于食品、藥品和化妝品等領域。

甘草次酸是由甘草酸(Glycyrrhizin,GL)水解兩個葡萄糖醛酸基得到的產物，屬于五環三萜類化合物。甘草次酸作為一種重要的天然產物，目前合成的主要手段為化學合成法和酶催化法。針對化學合成法存在的環境污染、反應工藝復雜等問題，酶催化具有專一性強、副反應小、反應條件溫和等優點，因此已被廣泛應用于前體藥物的結構修飾等方面。

目前常用于催化甘草酸得到甘草次酸的酶為：β-葡萄糖醛酸苷酶。然而經研究發現，自然界現有β-葡萄糖醛酸苷酶普遍存在含量少、穩定性差、底物特異性不高、催化能力低等問題，遠不能滿足生產需求。

自上世紀50年代起，國外就有學者對來源于動物體和大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸苷酶做了研究，之后各國學者在葡萄球菌、乳酸菌、瘤胃球菌等細菌，青霉菌、曲霉菌、酵母菌等真菌，黃芪、擬南芥、煙草、水稻、玉米等高等植物中檢測出該酶的活性。國內外學者有關β-葡萄糖醛酸苷酶的研究主要集中在腸桿菌科和哺乳動物中。可見，野生的β-葡萄糖醛酸苷酶廣泛存在于動植物及微生物中，可通過常規技術手段獲得各類生物體中的野生β-葡萄糖醛酸苷酶，并且不同類型的生物體中分離得到的野生β-葡萄糖醛酸苷酶的表達量、底物識別能力、催化活性、穩定性、產物得率都各自存在優勢和缺陷。

例如，來源于米曲霉的β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS在底物識別方面不專一且底物濃度對酶活性影響較大，比酶活不高。而來源于土曲霉的β-葡萄糖醛酸苷酶AtGUS的熱穩定性非常差，很難用于大規模發酵生產，同時其表達情況不好。來源于焦曲霉的兩種β-葡萄糖醛酸苷酶：AuGUSⅠ和AuGUSⅡ雖然均可水解GL生成GA，但是其活性較差且難于異源表達。除此之外，還有來源嗜松藍狀菌的TpGUS，還有來源于大腸桿菌的EGUS，和人的HGUS等很多種酶。

本領域公知：選取任意兩種各自優缺點互補的酶進行重組來獲得兼顧二者優點的重組酶，概率是很低的，本領域已報道的成功的重組酶并不多，而通過重組獲得比原始野生酶具有顯著優勢的重組酶的例子幾乎沒有。

盡管本領域人工制備重組酶的技術手段已非常成熟，但要從幾乎無數種不同來源的β-葡萄糖醛酸苷酶中選擇野生酶做為改造對象并成功獲得可高效制備甘草次酸且適用于甘草次酸大規模工業生產的重組酶并非易事。

因此，本領域亟需開發一種底物識別能力強、催化活性好、穩定性好、產物得率高的新型重組酶，用于高效制備甘草次酸及甘草次酸大規模工業生產。

發明內容

本發明基于本領域客觀存在的上述疑難和需求，開發得到一種比原始野生酶表達量、穩定性、催化效率高出數倍、且底物轉化率和目標產物得率均十分突出的重組酶，可用于工業上大規模生產甘草次酸。

本發明的技術方案如下：