[發明專利]通過組織培養獲得梔子苷的方法

有效

• 申請號: 201811563779.2
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109644869B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 陳建榮;劉芳;趙晨曦;唐偉卓;唐映紅
• 申請（專利權）人: 長沙學院
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01H4/00;A01H1/08
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理有限公司 11368
• 代理人: 孫國棟

梔子中含多余種生物活性物質，國內外公認的梔子有效成分為環烯醚萜類物質，其中含量最高的為梔子苷，又稱為京尼平苷。由于梔子是梔子果實是梔子苷的唯一天然獲得來源，梔子苷的獲取完全依賴于梔子果實，通過植物細胞工程篩選產梔子細胞進行規模化培養是解決梔子來源短缺的有效途徑之一。目前還未見有通過細胞培養生產梔子苷的報道。本發明有效的解決了梔子細胞生長與梔子苷含量下降之間的矛盾，可以在短期內以內獲得富含梔子苷的新鮮細胞，培養所得細胞的梔子苷含量是種子細胞中梔子苷含量的數倍，且不受自然條件的影響和限制。

技術領域

本發明是生物技術領域，特別涉及一種采用植物細胞培養技術生產梔子苷的方法。

背景技術

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasmi-noides Ellis的干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛等作用，梔子苷是梔子的次生代謝產物，其化學結構為環烯醚萜的葡萄糖苷。梔子中含40余種生物活性物質，主要為環烯醚萜類和揮發油類，而國內外公認的梔子有效成分為環烯醚萜類物質，其中含量最高的為梔子苷，又稱為京尼平苷，其苷元為京尼平。

朱文佩等以不同成熟度的梔子果實為樣品，采用高效液相色譜法測定，為確定最適采收期奠定基礎，結果表明不同成熟度果實樣品的梔子苷含量隨成熟度提高而下降。這與何國振等報道的不同成熟期梔子果實中梔子苷含量變化結果一致；吳小燕等研究表明梔皮和梔仁中主要活性成分的分布是有一定特征規律的，其中環烯醚萜苷類的代表性成分梔子苷富集于梔仁(種子)中。

由于梔子是梔子果實是梔子苷主要天然獲得來源，梔子苷的獲取完全依賴于梔子果實，而梔子苷的含量與梔子果實成熟度呈負相關，因此通過天然途徑獲取梔子苷成本較高，而且產量不穩定。

通過植物細胞工程篩選產梔子細胞進行規模化培養是解決梔子來源短缺的有效途徑之一。早在1989年，日本科學家就進行了梔子組織培養生產次生代謝產物的研究，而國內對梔子愈傷組織獲得初生代謝產物和次生代謝產物的研究起步較晚。在獲取初生代謝產物方面，石若夫等篩選出適宜梔子多糖合成的懸浮細胞株及培養條件。在獲取次生代謝產物方面，鐘青萍等篩選出適宜梔子愈傷組織生長和梔子黃色素產生的培養基。陳書安等為解決藏紅花資源短缺問題，研究了梔子愈傷組織的誘導，篩選出藏紅花素含量高、生長快速且不易褐化的梔子愈傷組織細胞系，為解決藏紅花素資源短缺等問題提供了種子資源。目前還未見有通過細胞培養生產梔子苷的報道。本發明人長期從事梔子栽培和組織培養研究，旨在為藥用梔子提供優質遺傳資源，在以提取梔子苷為目的的藥用梔子創新中，發明人嘗試采用植物細胞工程技術改造種質，取得了較好的效果。

發明內容

本發明的目的通過組織培養獲得梔子苷，減少季節、氣候和種質資源對梔子苷生產的影響。包括下述步驟：

1、果實離體前誘變處理

梔子坐果期，用秋水仙素處理梔子果，處理結束后，用清水對存活的果實進行噴霧淋洗；所述梔子果實的直徑為2-3mm,秋水仙素溶液濃度為0.6-1.2％，處理時長24-36小時；進一步的，秋水仙素溶液中還添加2-6mg/TDZ。

或者，對花期的梔子進行誘導，每天用濃度為0.6-1.2％的秋水仙素噴灑花芽，持續時間為3-9天。進一步的，秋水仙素溶液中還添加2-6mg/TDZ。

2、誘導含多倍體細胞的愈傷組織

8月中旬采摘未成熟的新鮮梔子果實撥開取其種子并消毒，通過無菌操作將消毒處理的種子撥去種皮，并用解剖刀將脫皮的梔子仁按橫切面切成兩半，接種在脫分化培養基上，25℃左右室溫下培養7-10天，獲得種仁愈傷組織；

以2n＝22為對照，采用流式細胞儀對愈傷組織進行倍性分析。根據待測樣品與對照樣品熒光強度峰值的大小關系計算出待測樣品的倍性，發現愈傷組織發生染色體倍增的現象占總體的85％以上，所有愈傷組織都為混倍體。

3、繼代培養