[發明專利]一種厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉染方法

有效

• 申請號: 201811562874.0
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109456994B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 李一峰;梁簫;程之揚;陳珂;竹攸汀;楊金龍
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于水產生物基因工程領域，公開了一種厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉染方法，根據克隆得到厚殼貽貝甲狀腺素受體基因全長序列設計siRNA，采用不同參數設置分析不同脈沖模式對甲狀腺素受體基因的敲減情況；收集電穿孔轉染后96h的幼蟲，提取幼蟲RNA；設計甲狀腺素受體基因引物，利用熒光定量PCR檢測甲狀腺素受體基因的表達情況。本發明與未加siRNA和無義siRNA處理后進行比較，結果顯示加入甲狀腺素受體基因siRNA顯著降低了該基因的表達量，敲減效率近100％。

技術領域

本發明屬于水產生物基因工程領域，尤其涉及一種厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉染方法。

背景技術

目前，業內常用的現有技術是這樣的：

厚殼貽貝Mytilus coruscus是廣泛分布于我國沿海的海水經濟貝類，隸屬于軟體動物門雙殼綱，是我國重要的養殖經濟貝類，我國浙江省嵊泗縣是厚殼貽貝的主產區。厚殼貽貝個體大，肉質肥美，是含優質蛋白質的雙殼貝類海產品，營養價值高，深受我國沿海地區人民的喜愛。

厚殼貽貝的苗種供應主要來源于人工育苗，幼蟲附著變態是人工育苗中非常重要的一個階段，若幼蟲不能完成正常變態，則會出現大批量死亡現象。目前，厚殼貽貝人工繁殖技術中所存在的問題一直沒有得到解決，育苗成活率和苗種品質一直不穩定，導致苗種供不應求。例如，浮游幼蟲附著變態率低，且在附著變態階段出現大規模死亡現象等問題。然而，海產貝類幼體的基礎科學研究和遺傳改造手段還遠遠不能滿足應用研究的需要。海產貝類幼體的獲得具有一定季節性，受精卵數量多且個體小，幼體成活率低，使得目前一直未建立一個穩定、高效的研究方法。

綜上所述，現有技術存在的問題是：

通量低（換句話說就是在短時間無法完成大量無脊椎動物幼體的基因編輯技術），例如顯微注射。

成本高，例如脂質體混合siRNA轉染雖然通量較顯微注射高，但是其價格非常昂貴（1.5 ml約2-4千元人民幣），且轉染效率在甲殼類藤壺中為60%。低與本方案中的雙殼貝類厚殼貽貝。

目前基因敲除/敲減技術是通過對特定基因進行永久沉默或阻止其表達的方法。在海產貝類幼體中，顯微注射因效率低且難以重復而極少使用。基于化學轉化在海產貝類幼體研究中的報道也很少，例如，脂質體因價格昂貴而難以推廣使用。電穿孔方法相比具有簡便、相對穩定等優點。而目前對于利用電穿孔技術在海產貝類幼體中進行基因敲減的研究仍不成熟。本領域需要建立一種能夠高效、穩定的電穿孔敲減基因表達的方法，觀察特定靶基因缺失后的表型，并研究可能進一步對相關生命現象所造成的影響，進而推測該基因的生物學功能。

解決上述技術問題的難度和意義：

解決上述技術問題的難度在于進行活體實驗，也就是把厚殼貽貝的幼體通過電穿孔的方法仍能保持大量幼蟲存活，并且基因敲減的效率能達到最優。在貝類中并沒有任何報道，也沒有相應所建立的針對在貝類幼體中依賴于電穿孔的方法；

意義：本發明需要建立一種能夠在貝類中高效、穩定的電穿孔敲減基因表達的方法。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉染方法。本發明提高了轉染的通量，也就是在短時間內可以對很多幼蟲進行基因編輯，而且不需要脂質體，降低了轉染的成本。

本發明是這樣實現的，一種厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉染方法，所述厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉染方法包括：

眼點幼蟲的篩選：將厚殼貽貝從擔輪幼蟲在培養箱中培養至眼點幼蟲階段；

siRNA電穿孔轉染:對所篩選的眼點幼蟲經無菌過濾海水清洗；將厚殼貽貝眼點幼蟲轉移至含有無菌過濾海水和厚殼貽貝甲狀腺素受體基因siRNA的電擊杯中；進行方波脈沖處理；待眼點幼蟲復蘇后，轉移至自然海水中培養，收集眼點幼蟲樣品用于RNA提取用于熒光定量PCR驗證；