[發(fā)明專利]一種厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉(zhuǎn)染方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811562874.0 | 申請日： | 2018-12-20 |
| 公開（公告）號： | CN109456994B | 公開（公告）日： | 2021-05-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李一峰;梁簫;程之揚;陳珂;竹攸汀;楊金龍 | 申請（專利權(quán)）人： | 上海海洋大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/87 | 分類號： | C12N15/87;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 北京金智普華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401 | 代理人： | 楊采良 |
| 地址： | 200000 上*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 貽貝 眼點 幼蟲 穿孔 轉(zhuǎn)染 方法 | ||
1.一種厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，所述厚殼貽貝眼點幼蟲的電穿孔轉(zhuǎn)染方法包括：
眼點幼蟲的篩選：將厚殼貽貝從擔輪幼蟲以5個/ml幼蟲密度并在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至眼點幼蟲階段；每兩天更換一次海水，海水溫度為18℃，海水經(jīng)混合纖維膜過濾，鹽度為30‰；選用殼長為320 μm、殼寬280 μm且形狀規(guī)則的眼點幼蟲用于電穿孔轉(zhuǎn)染；
siRNA電穿孔轉(zhuǎn)染:對所篩選的眼點幼蟲經(jīng)無菌過濾海水清洗；將100-300只厚殼貽貝眼點幼蟲轉(zhuǎn)移至含有1 ml無菌過濾海水和0.4 μg或0.8 μg厚殼貽貝甲狀腺素受體基因siRNA的0.4 cm伯樂電擊杯中；進行方波脈沖處理；待眼點幼蟲復(fù)蘇后，將眼點幼蟲轉(zhuǎn)移至18℃的自然海水中培養(yǎng)96 h，96 h后收集眼點幼蟲樣品用于RNA提取用于熒光定量PCR驗證；
所述0.4 cm伯樂電擊杯的體積為1.5 ml；
所述方波脈沖處理的參數(shù)設(shè)置為：一次5 ms的100 V電場脈沖，然后是十次20 ms的50V電場脈沖，每次脈沖電壓之間間隔1 s；
所述眼點幼蟲復(fù)蘇的時間為：5~10 min；
所述siRNA是根據(jù)厚殼貽貝甲狀腺素受體基因全長設(shè)計的長度為21 bp的雙鏈siRNA5′-GCUGAAAUCCUGCUGUUUAtt-3′，無義siRNA5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3′；
所述熒光定量PCR驗證為：采用引物對對所述厚殼貽貝甲狀腺素受體基因及兩個內(nèi)參基因EF-1α和α Tubulin的表達進行分析；
所述引物對為：
TR-F TCAACTTCATCCTCATCGTCAC；
TR-R CGCATCAGTACACACAACACAT；
EF-1α-F CACCACGAGTCTCTCCCTGA；
EF-1α-R GCTGTCACCACAGACCATTCC；
α Tubulin-F TTGCAACCATCAAGACCAAG；
α Tubulin-R TGCAGACGGCTCTCTGT。
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