[發明專利]一種哺乳動物胚胎性別鑒定方法

有效

• 申請號: 201811562124.3
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109402244B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 張明;趙秀玲;左二偉;陸陽清;魏巍
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/6879
• 分類號: C12Q1/6879;C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 蘇雪雪

本發明涉及性別鑒定技術領域，特別涉及一種哺乳動物胚胎性別鑒定方法，本發明通過在Y染色體上插入熒光報道基因，通過熒光報道基因的熒光表達，準確鑒定出哺乳動物的胚胎性別，該方法簡單、高效、準確、損傷小；在構建Y染色體含熒光報道基因的雄性哺乳動物模型的過程中，選擇位于Ddx3y和Uty基因的間隔區為打靶區進行外源基因的整合，降低基因打靶位點的選擇對轉基因動物自身的影響；在基因編輯過程中采用Cas9蛋白和根據打靶區基因序列設計的單導向sgRNA，能準確的對靶位點DNA進行切割，定向的在Y染色體的Ddx3y和Uty基因之間插入熒光報道基因，使得基因敲入手段高效、簡單。

【技術領域】

本發明涉及性別鑒定技術領域，特別涉及一種哺乳動物胚胎性別鑒定方法。

【背景技術】

性別控制技術是通過對動物的正常生殖過程進行人為干預，從而使成年雌性動物生產出人們期望性別后代的一門生物技術。這一技術對于提高畜牧生產中限性性狀生產效益，避免伴性遺傳病的發生，加快育種進程等方面都有重要的意義。Y染色體上性別決定序列的發現是哺乳動物性別決定理論的重要突破，對性別控制技術的發展意義重大。目前性別控制的方法主要集中在兩個方面，一個是精子水平，另一個是胚胎水平。

分離X、Y精子和鑒定早期胚胎的性別是目前控制后代性別比例最有效的兩種方法。X、Y精子頭部DNA含量的差異使通過流式細胞術分離X、Y精子成為可能，通過流式細胞術分選X、Y精子，然后根據需要用收集的X或Y精子和卵子進行受精，利用該方法進行性別控制的研究已經在兔子、豬、牛、羊、水牛等多種動物上獲得了成功。但目前存在的主要問題還是分離成本高，很難在農業生產上廣泛應用。其他分離X、Y精子的方法包括電泳、密度梯度離心和免疫學等，都未能取得滿意的結果，而且重復性差，無法在生產上運用。

目前，哺乳動物附植前胚胎性別鑒定最有效的方法主要是胚胎核型分析和PCR法，但這兩種方法都需要從胚胎中取出部分細胞，因此會對胚胎的后續發育造成一定程度的損傷。另外，胚胎核型分析操作程序復雜，周期長，也限制了這一方法的推廣應用。而PCR的方法雖然靈敏性很高，但也容易污染，易出現假陽性，在應用推廣中也有一定的局限性。雖然性別控制技術已經取得了一定的成就和發展，但當前這些方法的局限性限制了其在畜牧生產中的推廣和使用。因此，開發一種更簡單高效的性別控制方法對于農業生產的發展至關重要。

【發明內容】

鑒于上述內容，有必要提供一種更簡單高效的性別控制方法，該方法能精確的對哺乳動物胚胎進行性別鑒定，同時還降低了PCR假陽性的發生率，使胚胎鑒定結果達到100％的準確率。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種哺乳動物胚胎性別鑒定方法，所述方法為：構建Y染色體含熒光報道基因的雄性哺乳動物模型；雄性哺乳動物與雌性哺乳動物進行交配后，通過觀察熒光基因在胚胎中的表達鑒定動物胚胎性別為雄性或雌性。

進一步的，所述雄性哺乳動物模型的構建方法為：在Y染色體兩相鄰的基因間選擇打靶區，并確定打靶序列，根據打靶序列構建含熒光報道基因的donor載體；然后在sgRNA和Cas9 mRNA的共同作用下，Y染色體基因組被剪切，然后通過DNA存在修復模板的情況下通過同源重組進行修復的功能，將熒光報道基因定點插入Y染色體中。

進一步的，所述打靶區位于Ddx3y基因和Uty基因之間。

進一步的，所述打靶序列為5’-AGACTAGAGAGGCTCAATTCTGG-3’。

進一步的，所述含熒光報道基因的donor載體的序列為SEQ ID NO：2。

進一步的，所述sgRNA的體外轉錄模板的獲得方式為：以質粒px330為模板，合成引物序列并采用PCR擴增雙鏈DNA，為體外轉錄sgRNA提供模板，所述引物序列的上游引物序列為：sgRNA-IVT-F：